Rola polimorfizmów w klastrze genów IL-1

Celuje:

Główny cel: zbadanie, czy polimorfizmy w klastrze genów Il-1 chronią przed jaskrą w populacjach azjatyckich.

Cel drugorzędny: Określenie, czy istnieją różnice w polimorfizmach pojedynczych nukleotydów klastra genów Il-1 u pacjentów z jaskrą z normotensją w porównaniu z pacjentami z jaskrą z wysokim ciśnieniem.

Tło

Jaskry to grupa heterogennych neuropatii nerwu wzrokowego charakteryzujących się postępującą utratą aksonów w nerwie wzrokowym. Na podstawie danych WHO Global Data Bank on Blindness, jaskra dotyczy 5,1 miliona spośród szacowanych 38 milionów osób niewidomych na świecie.1 Jaskra dotyka około 70 milionów ludzi na całym świecie i jest główną przyczyną nieodwracalnej ślepoty na świecie2. Ponieważ liczba osób starszych na świecie szybko rośnie, zachorowalność na jaskrę wzrośnie, powodując wzrost kosztów opieki zdrowotnej i obciążenia ekonomiczne. Ma to istotne implikacje dla zdrowia publicznego w przypadku stanu, w którym raz ustalona utrata wzroku nie może zostać odwrócona. Głównym czynnikiem ryzyka jaskry jest podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe spowodowane zmniejszeniem odpływu cieczy wodnistej.

Wcześniejsze badania wykazały, że jaskra jest główną przyczyną chorobowości wzrokowej w Singapurze3-5. W badaniu populacyjnym przeprowadzonym wśród Chińczyków w Singapurze w dystrykcie Tanjong Pagar wystandaryzowana wiekowo częstość występowania jaskry wynosiła 3,2% (przedział ufności 95%, 2,3-4,1) w populacji w wieku 40 lat i starszych.3

Jaskra ma duże podłoże genetyczne, szacuje się, że odpowiada za jedną trzecią (zakres 20-60%) wszystkich przypadków jaskry, 6-8, chociaż niedawny raport sugeruje, że jest to niedoszacowanie.9 Heterogeniczność genetyczną ilustruje ponad 15 loci i 7 genów powodujących jaskrę zidentyfikowanych do tej pory, 10, w tym 2 geny zidentyfikowane dla POAG.11-12 Stwierdzono, że różnorodne mechanizmy genetyczne indukują jaskrę otwartego kąta i jaskrę rozwojową, w tym mutacje kodujące, szczególnie w czynnikach transkrypcyjnych, 13 zmienione dawkowanie genów 14 i dominujące skutki negatywne. 15

Interleukina-1 jest ważnym mediatorem stanu zapalnego. Istnieją 2 cytokiny prozapalne, Il-1 alfa i Il-1 beta. Oba są wytwarzane przez monocyty, makrofagi i komórki nabłonkowe jako reakcje gospodarza na uszkodzenie tkanki. Geny kodujące Il-1 znajdują się w regionie 430 kb na chromosomie 2q14.216. Wykazano, że polimorfizmy klastra genów IL-1 zmieniają ekspresję białka. Polimorfizmy pojedynczych nukleotydów powiązano z innymi chorobami, takimi jak stan przedrzucawkowy wśród innych schorzeń17.

_Stwierdzono, że ekspresja śródbłonkowej cząsteczki adhezyjnej leukocytów-1 (ELAM-1) w komórkach siateczki beleczkowej jest diagnostycznym markerem jaskry18. _Ekspresja ELAM-1 jest kontrolowana przez aktywację autokrynnej pętli sprzężenia zwrotnego IL-1, która jest kontrolowana przez czynnik transkrypcyjny NF-Kappa-Beta. Wykazano, że Il-1 wytwarzana endogennie przez komórki jaskry hamuje odpowiedź apoptotyczną na stres oksydacyjny18. Donoszono również, że IL-1 zwiększa łatwość odpływu poprzez stymulację ekspresji enzymów metaloproteinazy macierzy, co z kolei zmniejsza oporność zewnątrzkomórkową19-22. Wpływ Il-1 na syntezę tlenku azotu powodujący rozluźnienie napięcia mięśni rzęskowych może również przyczynić się do zwiększenia odpływu cieczy wodnistej23.

Ostatnio Wang i wsp. wykazali, że warianty IL-1 skutkują zwiększonym wydzielaniem IL-1, a tym samym zmniejszają ryzyko jaskry pierwotnej otwartego kąta (POAG) 24. Zostało to zaprezentowane na niedawnym spotkaniu ARVO 2005 na Florydzie, w USA, pod hasłem „Nowe pomysły w leczeniu jaskry”. Grupa kierowana przez dr Elizabeth Fini z Bascom Palmer Eye Institute w Miami zidentyfikowała warianty genetyczne (+3953T) Il-1 β, który jest czynnikiem ochronnym przed POAG. Ocenili genomowe DNA 100 pacjentów z POAG i 104 zdrowych osób z grupy kontrolnej w populacji kaukaskiej w ciągu 40 lat. Częstość występowania alleli Il-1 Beta (+3953T) była istotnie wyższa w normalnych kontrolach niż w grupie POAG (28% vs. 17%, p=0,01). Stwierdzili również, że częstość alleli Il-1 alfa (-889T) była wyższa w grupie kontrolnej normalnej niż w grupie POAG na granicy istotności (39% w porównaniu z 29%, p=0,06). Może to okazać się istotne przy większej liczebności próby.

W tym projekcie mamy nadzieję ustalić, czy polimorfizmy w klastrze genów Il-1 występujące u rasy kaukaskiej są również ochronne dla pacjentów z jaskrą w populacjach azjatyckich. Naszym celem jest również ustalenie, czy istnieją różnice w rozmieszczeniu polimorfizmów klastra genów Il-1 u pacjentów z jaskrą z normotensją w porównaniu z pacjentami z jaskrą z wysokim ciśnieniem. Badani będą zarówno pacjenci z jaskrą pierwotną z zamkniętym kątem przesączania, jak i z jaskrą pierwotną z otwartym kątem przesączania. Badanie będzie pierwszym, które zbada takie zmiany w PACG, głównej przyczynie ślepoty w Azji i uważanej za chorobę zależną od IOP. Wyniki badań mogą mieć implikacje dla genetycznych podstaw jaskry, kładąc nacisk na rolę układu odpornościowego w odpowiedzi IOP i patogenezie jaskry. Jest to pilotażowe badanie roli polimorfizmów związanych z układem odpornościowym iw zależności od wyników możemy rozpocząć szersze badanie roli innych genów odpornościowych w jaskrze.

Metody

Rekrutacja pacjentów:

Co najmniej 300 pacjentów z pierwotną jaskrą zostanie zwerbowanych do badania z klinik jaskry w Singapore National Eye Centre. Będą to pacjenci z PACG, POAG i NTG. Będzie kolejnych 100 pacjentów z grupy kontrolnej bez klinicznych objawów jaskry rekrutowanych z klinik ogólnych. Osoby z wtórnym zamkniętym kątem przesączania i innymi chorobami oczu zostaną wykluczone.

Ocena i badanie pacjenta Badanie obu oczu będzie obejmowało najlepszą skorygowaną ostrość wzroku Snellena, goniskopię, pomiar ciśnienia wewnątrzgałkowego tonometrem aplanacyjnym Goldmanna, badanie przedniego odcinka oka, soczewki, ciała szklistego i siatkówki w lampie szczelinowej. Ponadto skaningowy oftalmoskop laserowy, tomograf siatkówki Heidelberg (HRT, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Niemcy) zostanie wykorzystany do obrazowania tarczy nerwu wzrokowego u wszystkich pacjentów. Globalne i segmentowe powierzchnie krążków i kubków będą analizowane bezpośrednio za pomocą oprogramowania HRT (wersja 2.01b) przy użyciu standardowej płaszczyzny odniesienia. Powierzchnia obręczy zostanie obliczona poprzez odjęcie powierzchni kubka od powierzchni tarczy. Nasilenie jaskry zostanie sklasyfikowane na podstawie globalnych wskaźników w polach widzenia, jak również na podstawie obszaru obręczy nerwowo-siatkówkowej HTZ. Długość osiowa zostanie również zmierzona za pomocą IOL-Master (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Niemcy). Od każdego pacjenta zostanie pobrane 10 ml krwi przez nakłucie żyły.

Zastosowane zostaną standardowe kryteria włączenia dla jaskry, czyli obecność jaskrowej neuropatii nerwu wzrokowego (zdefiniowanej jako utrata obręczy nerwowo-siatkówkowej ze stosunkiem panewki do krążka równym 0,7 lub większym) z odpowiednią utratą pola widzenia. PACG będzie definiowana jako obecność co najmniej 180 stopni kąta, w którym siateczka beleczkowania nie jest widoczna w gonioskopii z obecnością jaskrowej neuropatii nerwu wzrokowego. Pacjenci z POAG będą mieli otwarte kąty podczas gonioskopii; Pacjenci z POAG, u których średnie ciśnienie wewnątrzgałkowe bez leczenia jest stale niższe niż 21 mm Hg w badaniu dobowym, zostaną sklasyfikowani jako NTG.

Przygotowanie DNA i genotypowanie

Genomowy DNA zostanie wyekstrahowany z leukocytów krwi obwodowej za pomocą zestawów Nucleon DNA Extraction. Warianty Il-1alfa (-889), Il-beta (-511) i Il-1beta (+3953) zostaną wykryte przez specyficzną reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) (przy użyciu starterów w Tabeli 1), a następnie trawienie restrykcyjne produkty trawienia enzymatycznego, jak opisano w Tabeli 1. Potwierdzenie polimorfizmów byłoby przeprowadzone przez bezpośrednie sekwencjonowanie.

Metodologia jest dość prosta, a prace laboratoryjne mogą być wykonywane przez dr Alicię How (Registrar, SNEC) podczas jej cotygodniowej sesji badawczej. Dr How przeszedł podstawowe szkolenie w laboratorium genetyki molekularnej i będzie nadzorowany przez dr Aung Tin.

Tabela 1. Sekwencja startera, warunki PCR i enzym dla IL-1α (-889), IL-1β (-511) i IL-1β(+3953)

Polimorfizm Sekwencja startera Temperatura przyłączania (oC) Enzym Oczekiwane produkty DNA (bp) IL-1alfa (-889) Forward 5'-GCATGCCATCACACCTAGTT-3' 58 Nco1 C:194 Reverse 5'-TTACATATGAGCCTTCCATG-3' T:178,16 IL- 1beta (-511) Do przodu 5'-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3' 60 Bsu36I, C:304 Do tyłu 5'-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3' T:190,114 IL-1beta (+3953) Do przodu 5'-GTTGTCATCAGACTTTGACC-3' 60 TaqI, C: 135,114 Odwróć 5'-TTCAGTTCATATGGACCAGA-3' T:249