Polymorfis rolle i IL-1-genklyngen

Mål:

Primært mål: At undersøge, om polymorfier i Il-1-genklyngen er beskyttende for glaukom i asiatiske populationer.

Sekundært mål: At bestemme, om der er forskelle i enkeltnukleotidpolymorfismer af Il-1-genklyngen hos normotensive glaukompatienter versus højtryksglaukompatienter.

Baggrund

Grøn stær er en gruppe af heterogene optiske neuropatier karakteriseret ved progressivt tab af axoner i synsnerven. Baseret på WHO Global Data Bank on Blindness, tegner grøn stær sig for 5,1 millioner af de anslåede 38 millioner blinde i verden.1Glaukom påvirker omkring 70 millioner mennesker verden over og er den førende årsag til irreversibel blindhed i verden2. Da antallet af ældre i verden hurtigt stiger, vil glaukomsygeligheden stige, hvilket medfører øgede sundhedsudgifter og økonomisk byrde. Dette har vigtige folkesundhedsmæssige konsekvenser for en tilstand, hvor synstab, når først det er konstateret, ikke kan vendes. Den største risikofaktor ved glaukom er forhøjet intraokulært tryk på grund af reduktion i vandig udstrømning.

Tidligere undersøgelser har vist, at grøn stær er en væsentlig årsag til synsforstyrrelser i Singapore3-5. I en befolkningsbaseret undersøgelse udført på kinesiske singaporeanere i Tanjong Pagar-distriktet, blev den aldersstandardiserede forekomst af glaukom fundet at være 3,2 % (95 % konfidensinterval, 2,3-4,1) i befolkningen på 40 år og ældre.3

Grøn stær har et væsentligt genetisk grundlag, anslået til at udgøre en tredjedel (interval 20-60%) af alle glaukomtilfælde, 6-8, selvom en nylig rapport tyder på, at dette er en undervurdering.9 Genetisk heterogenitet illustreres af de mere end 15 loci og 7 glaukom-fremkaldende gener identificeret til dato, 10 inklusive 2 gener identificeret for POAG.11-12 En række forskellige genetiske mekanismer har vist sig at inducere åbne vinkler og udviklingsmæssige glaukomer, og disse omfatter kodende mutationer, især i transkriptionsfaktorer, 13 ændret gendosering14 og dominerende negative effekter.15

Interleukin-1 er en vigtig mediator af inflammation. Der er 2 pro-inflammatoriske cytokiner, Il-1 alfa og Il-1 beta. Begge produceres af monocytter, makrofager og epitelceller som værtsreaktioner på vævsskade. Generne, der koder for Il-1, er placeret inden for en 430 kb region på kromosom 2q14.216. Polymorfier af Il-1-genklyngen har vist sig at ændre protein-ekspression. Enkeltnukleotidpolymorfier er blevet forbundet med andre sygdomme, såsom præeklampsi blandt andre medicinske tilstande17.

_Ekspression af det endoteliale leukocytadhæsionsmolekyle-1 (ELAM-1) i trabekulære meshwork-celler er blevet identificeret som en diagnostisk markør for glaukom18. _Ekspression af ELAM-1 styres ved aktivering af Il-1 autokrin feedback-loop, som styres gennem transkriptionsfaktor NF-Kappa -Beta. Det er blevet vist, at Il-1 produceret endogent af glaukomceller hæmmer det apoptotiske respons på oxidativt stress18. Il-1 er også blevet rapporteret at øge udstrømningsfaciliteten ved at stimulere _ekspressionen af ​​matrix metalloproteinase enzymer, hvilket igen reducerer ekstra cellulær modstand19-22. Effekten af ​​Il-1 på syntesen af ​​nitrogenoxid, der forårsager en afslapning i ciliær muskeltonus, kan også være medvirkende til at øge vandig udstrømning23.

For nylig har Wang et al vist, at Il-1-varianter resulterer i øget sekretion af Il-1 og dermed reducerer risikoen for primær åbenvinklet glaukom (POAG) 24. Dette blev præsenteret på det nylige ARVO-møde 2005 i Florida, USA, under "Nye ideer i glaukom". Gruppen ledet af Dr. Elizabeth Fini fra Bascom Palmer Eye Institute, Miami, identificerede genetiske varianter (+3953T) af Il-1 β, som er en beskyttende faktor mod POAG. De vurderede genomisk DNA fra 100 POAG-patienter og 104 normale kontroller i den kaukasiske befolkning over 40 år. Allelfrekvensen af ​​Il-1 Beta (+3953T) var signifikant højere i normale kontroller end i POAG-gruppen (28 % versus 17 %, p=0,01). De fandt også, at allelfrekvensen af ​​Il-1 alfa (-889T) var højere i normale kontroller end i POAG-gruppen ved grænseoverskridende signifikans (39 % versus 29 %, p=0,06). Dette kan vise sig at være signifikant med en større stikprøvestørrelse.

I dette projekt håber vi at afgøre, om polymorfier i Il-1-genklyngen fundet i kaukasierne også er beskyttende for glaukompatienter i asiatiske populationer. Vi sigter også på at bestemme, om der er forskelle i fordelingen af ​​polymorfismer af Il-1-genklyngen hos normotensive glaukompatienter versus højtryksglaukompatienter. Både primær vinkellukning og primær åbenvinklet glaukompatienter vil blive undersøgt. Undersøgelsen vil være den første til at undersøge sådanne ændringer i PACG, en væsentlig årsag til blindhed i Asien, og anses for at være en IOP-afhængig sygdom. Undersøgelsesresultaterne kan have betydning for det genetiske grundlag for glaukom, hvilket sætter fokus på immunsystemets rolle i IOP-respons og glaukompatogenese. Dette er en pilotundersøgelse af immunsystemrelaterede polymorfiers rolle, og afhængigt af resultaterne kan vi gå i gang med en større undersøgelse af andre immungeners rolle i glaukom.

Metoder

Patientrekruttering:

Mindst 300 patienter med primær glaukom vil blive rekrutteret i undersøgelsen fra glaukomklinikker ved Singapore National Eye Centre. Dette vil bestå af PACG-, POAG- og NTG-patienter. Der vil være yderligere 100 kontrolpatienter uden klinisk tegn på glaukom rekrutteret fra de generelle klinikker. Personer med sekundær vinkellukning og andre øjensygdomme vil blive udelukket.

Patientvurdering og undersøgelse Undersøgelse af begge øjne vil omfatte bedst korrigeret Snellen synsstyrke, goniskopi, intraokulær trykmåling med Goldmann applanationstonometer, spaltelampeundersøgelse af det forreste segment, linse, glaslegeme og nethinde. Derudover vil et scannende laser oftalmoskop, Heidelberg retina tomograph (HRT, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Tyskland) blive brugt til at afbilde den optiske disk i alle emner. Globale og segmentelle disk- og kopområder vil blive analyseret direkte ved hjælp af HRT-software (version 2.01b) ved brug af standardreferenceplanet. Fælgarealet vil blive beregnet ved at trække skålarealet fra skiveområdet. Sværhedsgraden af ​​glaukom vil blive klassificeret efter globale indekser i synsfelterne samt efter HRT neuroretinal randområde. Aksial længde vil også blive målt med IOL-Master (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Tyskland). 10 ml blod vil blive udtaget fra hver patient ved venepunktur.

Standardiserede inklusionskriterier for glaukom vil blive brugt, hvilket er tilstedeværelsen af ​​glaukom optisk neuropati (defineret som tab af neuroretinal kant med et kop:skive-forhold på 0,7 eller mere) med kompatibelt synsfelttab. PACG vil blive defineret som tilstedeværelsen af ​​mindst 180 graders vinkel, hvori det trabekulære meshwork ikke er synligt ved gonioskopi med tilstedeværelsen af ​​glaukomatøs optisk neuropati. POAG-patienter vil have åbne vinkler ved gonioskopi; POAG-patienter med en gennemsnitlig IOP uden behandling, der konsekvent er mindre end 21 mm Hg ved daglig testning, vil blive klassificeret som NTG.

DNA-forberedelse og genotypning

Genomisk DNA vil blive ekstraheret fra leukocytter i det perifere blod ved hjælp af Nucleon DNA-ekstraktionssæt. Varianterne Il-1alpha (-889), Il-beta (-511) og Il-1beta (+3953) vil blive påvist ved specifik polymerasekædereaktion (PCR) (ved anvendelse af primere i tabel 1), efterfulgt af fordøjelse med restriktion enzymfordøjelser som beskrevet i tabel 1. Bekræftelse af polymorfier ville blive udført ved direkte sekventering.

Metoden er ret ligetil, og laboratoriearbejdet kan udføres af Dr. Alicia How (registrator, SNEC) under hendes forskningssession hver uge. Dr. How har gennemgået grundlæggende molekylær genetik laboratorietræning og vil blive overvåget af Dr. Aung Tin.

Tabel 1. Primersekvens, PCR-tilstand og enzym for IL-1α (-889), IL-1β (-511) og IL-1β(+3953)

Polymorfi Primersekvens Annealing Temp (oC) Enzym Forventede DNA-produkter (bp) IL-1alpha (-889) Fremad 5'-GCATGCCATCACACCTAGTT-3' 58 Nco1 C:194 Omvendt 5'-TTACATATGAGCCTTCCATG-3' T:178,16 IL 1beta (-511) Fremad 5'-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3' 60 Bsu36I, C:304 Omvendt 5'-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3' T:190.114 IL-1beta (+3953) Fremad 5'-GTTTGACCATQI 135.114 Omvendt 5'-TTCAGTTCATATGGACCAGA-3' T:249