Role polymorfismů v IL-1 genovém klastru

Cíle:

Primární cíl: Zkoumat, zda polymorfismy v klastru genů Il-1 chrání před glaukomem u asijských populací.

Sekundární cíl: Zjistit, zda existují rozdíly v jednonukleotidových polymorfizmech klastru genů Il-1 u pacientů s normotenzním glaukomem oproti pacientům s vysokotlakým glaukomem.

Pozadí

Glaukomy jsou skupinou heterogenních neuropatií zrakového nervu charakterizovaných progresivní ztrátou axonů v optickém nervu. Na základě Globální datové banky o slepotě WHO představuje glaukom 5,1 milionu z odhadovaných 38 milionů slepých na světě.1 ​​Glaukom postihuje přibližně 70 milionů lidí na celém světě a je hlavní příčinou nevratné slepoty na světě2. Vzhledem k tomu, že počet seniorů ve světě rychle roste, nemocnost na glaukom poroste, což způsobí zvýšené náklady na zdravotní péči a ekonomickou zátěž. To má důležité důsledky pro veřejné zdraví pro stav, kdy ztrátu zraku, jakmile se jednou objeví, nelze zvrátit. Hlavním rizikovým faktorem glaukomu je zvýšený nitrooční tlak v důsledku snížení odtoku vody.

Předchozí studie ukázaly, že glaukom je hlavní příčinou zrakové morbidity v Singapuru3-5. V populačním průzkumu provedeném na čínských Singapurčanech v okrese Tanjong Pagar byla zjištěna věkově standardizovaná prevalence glaukomu 3,2 % (95% interval spolehlivosti, 2,3–4,1) u populace ve věku 40 let a starší.3

Glaukom má hlavní genetický základ, odhaduje se, že tvoří třetinu (rozmezí 20–60 %) všech případů glaukomu, 6–8, ačkoli nedávná zpráva naznačuje, že jde o podcenění.9 Genetická heterogenita je ilustrována více než 15 lokusy a 7 dosud identifikovanými geny způsobujícími glaukom, 10 včetně 2 genů identifikovaných pro POAG.11-12 Bylo zjištěno, že různé genetické mechanismy vyvolávají glaukom s otevřeným úhlem a vývojový glaukom, mezi něž patří kódující mutace, zejména v transkripčních faktorech, 13 změněné dávkování genů14 a dominantní negativní účinky.15

Interleukin-1 je důležitým mediátorem zánětu. Existují 2 prozánětlivé cytokiny, Il-1 alfa a Il-1 beta. Oba jsou produkovány monocyty, makrofágy a epiteliálními buňkami jako reakce hostitele na poškození tkáně. Geny kódující IL-1 jsou umístěny v oblasti 430 kb na chromozomu 2q14.216. Ukázalo se, že polymorfismy klastru genů IL-1 mění expresi proteinu. Jednonukleotidové polymorfismy jsou mimo jiné spojovány s jinými nemocemi, jako je preeklampsie17.

_Exprese endoteliální leukocytární adhezní molekuly-1 (ELAM-1) v buňkách trabekulární síťoviny byla identifikována jako diagnostický marker glaukomu18. _Exprese ELAM-1 je řízena aktivací autokrinní zpětnovazební smyčky Il-1, která je řízena transkripčním faktorem NF-Kappa-Beta. Bylo prokázáno, že Il-1 produkovaný endogenně glaukomatózními buňkami inhibuje apoptotickou odpověď na oxidační stres18. Bylo také popsáno, že IL-1 zvyšuje schopnost odtoku stimulací exprese enzymů matricových metaloproteináz, což zase snižuje extracelulární rezistenci19-22. Účinek Il-1 na syntézu oxidu dusnatého způsobující relaxaci tonusu ciliárního svalstva může také přispět ke zvýšení odtoku vody23.

Nedávno Wang et al prokázali, že varianty Il-1 vedou ke zvýšené sekreci IL-1 a tím snižují riziko primárního glaukomu s otevřeným úhlem (POAG) 24. Toto bylo prezentováno na nedávném setkání ARVO v roce 2005 na Floridě v USA pod „Nové nápady v glaukomu“. Skupina vedená Dr. Elizabeth Fini z Bascom Palmer Eye Institute, Miami, identifikovala genetické varianty (+3953T) Il-1 β, což je ochranný faktor proti POAG. Hodnotili genomovou DNA od 100 pacientů s POAG a 104 normálních kontrol v kavkazské populaci během 40 let. Frekvence alel IL-1 Beta (+3953T) byla významně vyšší u normálních kontrol než ve skupině POAG (28 % oproti 17 %, p=0,01). Zjistili také, že frekvence alel Il-1 alfa (-889T) byla vyšší u normálních kontrol než ve skupině POAG s hraniční významností (39 % versus 29 %, p=0,06). To se může ukázat jako významné u větší velikosti vzorku.

V tomto projektu doufáme, že zjistíme, zda polymorfismy v klastru genů Il-1 nalezené u bělochů také chrání pacienty s glaukomem v asijské populaci. Naším cílem je také zjistit, zda existují rozdíly v distribuci polymorfismů klastru genů Il-1 u pacientů s normotenzním glaukomem oproti pacientům s vysokotlakým glaukomem. Budou studováni pacienti s primárním glaukomem s uzavřeným úhlem a primárním glaukomem s otevřeným úhlem. Studie bude první, která prozkoumá takové změny u PACG, hlavní příčiny slepoty v Asii a považované za onemocnění závislé na NOT. Výsledky studie mohou mít důsledky na genetický základ glaukomu, přičemž se zaměřuje na roli imunitního systému v odpovědi NOT a patogenezi glaukomu. Toto je pilotní studie role polymorfismů souvisejících s imunitním systémem a v závislosti na výsledcích se můžeme pustit do většího zkoumání role jiných imunitních genů u glaukomu.

Metody

Nábor pacientů:

Nejméně 300 pacientů s primárním glaukomem bude zahrnuto do studie z glaukomových klinik v Singapurském národním očním centru. To se bude skládat z pacientů s PACG, POAG a NTG. Z všeobecných klinik bude dalších 100 kontrolních pacientů bez klinických známek glaukomu. Jedinci se sekundárním uzávěrem úhlu a jinými očními chorobami budou vyloučeni.

Hodnocení a vyšetření pacienta Vyšetření obou očí bude zahrnovat nejlépe korigovanou Snellenovu zrakovou ostrost, gonoskopii, měření nitroočního tlaku Goldmannovým aplanačním tonometrem, vyšetření předního segmentu, čočky, sklivce a sítnice štěrbinovou lampou. Kromě toho bude k zobrazení optického disku u všech subjektů použit skenovací laserový oftalmoskop, sítnicový tomograf Heidelberg (HRT, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Německo). Globální a segmentální oblasti plotének a jamek budou analyzovány přímo pomocí softwaru HRT (verze 2.01b) za použití standardní referenční roviny. Plocha ráfku se vypočítá odečtením plochy misky od plochy disku. Závažnost glaukomu bude klasifikována podle globálních indexů v zorných polích a také podle oblasti neuroretinálního okraje HRT. Axiální délka bude také měřena pomocí IOL-Master (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Německo). Od každého pacienta bude odebráno 10 ml krve venepunkcí.

Budou použita standardizovaná inkluzní kritéria pro glaukom, což je přítomnost glaukomové neuropatie zrakového nervu (definovaná jako ztráta neuroretinálního okraje s poměrem pohárek: disk 0,7 nebo větším) s kompatibilní ztrátou zorného pole. PACG bude definována jako přítomnost úhlu alespoň 180 stupňů, ve kterém není trabekulární síťovina viditelná při gonioskopii s přítomností glaukomové neuropatie zrakového nervu. Pacienti POAG budou mít při gonioskopii otevřené úhly; Pacienti s POAG s průměrným IOP bez léčby, který je trvale nižší než 21 mm Hg při denním testování, budou klasifikováni jako NTG.

Příprava DNA a genotypizace

Genomová DNA bude extrahována z leukocytů periferní krve pomocí souprav Nucleon DNA Extraction kits. Varianty Il-1alfa (-889), Il-beta (-511) a Il-lbeta (+3953) budou detekovány specifickou polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) (s použitím primerů v tabulce 1), následovanou štěpením s restrikcí enzymové štěpení, jak je popsáno v tabulce 1. Potvrzení polymorfismů by bylo provedeno přímým sekvenováním.

Metodologie je poměrně přímočará a laboratorní práci může provádět doktorka Alicia How (registrátorka, SNEC) během svého výzkumného sezení každý týden. Dr. How prošel základním laboratorním školením molekulární genetiky a bude pod dohledem Dr. Aung Tina.

Stůl 1. Sekvence primeru, podmínky PCR a enzym pro IL-1α (-889), IL-1β (-511) a IL-1β(+3953)

Polymorfismus Sekvence primeru Teplota žíhání (oC) Enzym Očekávané produkty DNA (bp) IL-1alfa (-889) Forward 5'-GCATGCCATCACACCTAGTT-3' 58 Nco1 C:194 Reverse 5'-TTACATATGAGCCTTCCATG-3' T:178,16 . 1beta (-511) vpřed 5'-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3' 60 Bsu36I, C:304 vzad 5'-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3' T:190,114 IL-1beta (+3953) vpřed 5'-CAACTG3CC,CTTGATT:0 135,114 Reverse 5'-TTCAGTTCATATGGACCAGA-3' T:249