Polymorfismien rooli IL-1-geeniklusterissa

Tavoitteet:

Ensisijainen tavoite: Tutkia, suojaavatko Il-1-geeniklusterin polymorfismit glaukoomalta Aasian populaatioissa.

Toissijainen tavoite: Selvittää, onko Il-1-geeniklusterin yhden nukleotidin polymorfismissa eroja normotensiivisilla glaukoomapotilailla verrattuna korkeapaineglaukoomapotilaisiin.

Tausta

Glaukoomat ovat ryhmä heterogeenisiä optisia neuropatioita, joille on tunnusomaista asteittainen aksonien menetys näköhermossa. WHO:n Global Data Bank on Blindness -tietopankin mukaan glaukooma on 5,1 miljoonaa maailman arviolta 38 miljoonasta sokeasta.1Glaukooma Se vaikuttaa noin 70 miljoonaan ihmiseen maailmanlaajuisesti ja on johtava peruuttamattoman sokeuden aiheuttaja maailmassa2. Kun ikääntyneiden määrä maailmassa kasvaa nopeasti, glaukoomaan sairastuvuus lisääntyy, mikä lisää terveydenhuollon kustannuksia ja taloudellista taakkaa. Tällä on merkittäviä kansanterveydellisiä vaikutuksia tilaan, jossa näön heikkenemistä, kun se on todettu, ei voida korjata. Glaukooman tärkein riskitekijä on kohonnut silmänsisäinen paine, joka johtuu veden ulosvirtauksen vähenemisestä.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että glaukooma on pääasiallinen näköhäiriöiden syy Singaporessa3-5. Väestöpohjaisessa tutkimuksessa, joka tehtiin kiinalaisille singaporelaisille Tanjong Pagarin alueella, glaukooman ikästandardisoitu esiintyvyys oli 3,2 % (95 %:n luottamusväli, 2,3-4,1) vähintään 40-vuotiailla.3

Glaukoomalla on merkittävä geneettinen perusta, jonka arvioidaan muodostavan kolmanneksen (vaihteluväli 20–60 %) kaikista glaukoomatapauksista, 6–8, vaikka tuoreen raportin mukaan tämä on aliarvioitu.9 Geneettistä heterogeenisyyttä kuvaavat tähän mennessä tunnistetut yli 15 lokusta ja 7 glaukooman aiheuttavaa geeniä, joista 10, mukaan lukien 2 geeniä, jotka on tunnistettu POAG:lle.11-12 Monien erilaisten geneettisten mekanismien on havaittu indusoivan avoimen kulman ja kehitysglaukoomat, ja näihin kuuluvat koodaavat mutaatiot, erityisesti transkriptiotekijöissä, 13 muuttunut geeniannos14 ja hallitsevat negatiiviset vaikutukset.15

Interleukiini-1 on tärkeä tulehduksen välittäjä. On olemassa 2 pro-inflammatorista sytokiinia, Il-1 alfa ja Il-1 beeta. Molempia tuottavat monosyytit, makrofagit ja epiteelisolut isäntävasteina kudosvaurioille. Il-1:tä koodaavat geenit sijaitsevat 430 kb:n alueella kromosomissa 2q14.216. Il-1-geeniklusterin polymorfismien on osoitettu muuttavan proteiinin ilmentymistä. Yhden nukleotidin polymorfismit on yhdistetty muihin sairauksiin, kuten preeklampsiaan, muiden sairauksien ohella17.

Endoteelisen leukosyyttiadheesiomolekyylin-1 (ELAM-1) ilmentymisen trabekulaarisissa verkkosoluissa on havaittu olevan glaukooman diagnostinen merkki18. ELAM-1:n ilmentymistä kontrolloidaan aktivoimalla Il-1:n autokriininen takaisinkytkentäsilmukka, jota ohjataan transkriptiotekijän NF-Kappa-Beta kautta. On osoitettu, että glaukoomasolujen endogeenisesti tuottama Il-1 estää apoptoottista vastetta oksidatiiviselle stressille18. IL-1:n on myös raportoitu lisäävän ulosvirtausta stimuloimalla matriksin metalloproteinaasientsyymien ilmentymistä, mikä puolestaan ​​vähentää solunulkoista vastustuskykyä19-22. Il-1:n vaikutus typpioksidin synteesiin, joka aiheuttaa rentoutumista sädelihasten sävyssä, voi myös olla osaltaan lisäämässä vesien ulosvirtausta23.

Äskettäin Wang et al ovat osoittaneet, että Il-1-variantit lisäävät Il-1:n eritystä ja vähentävät siten primaarisen avoimen kulman glaukooman (POAG) riskiä 24. Tämä esiteltiin äskettäin pidetyssä ARVO-kokouksessa 2005 Floridassa, Yhdysvalloissa, kohdassa "Uusia ideoita glaukoomassa". Tohtori Elizabeth Finin johtama ryhmä Bascom Palmer Eye Institutesta Miamista tunnisti Il-1 β:n geneettiset variantit (+3953T), joka on suojaava tekijä POAG:ta vastaan. He arvioivat genomista DNA:ta 100 POAG-potilaalta ja 104 normaalilta kontrollilta valkoihoisessa populaatiossa yli 40 vuoden ajalta. Il-1 Betan alleelifrekvenssi (+3953T) oli merkittävästi korkeampi normaaleissa kontrolleissa kuin POAG-ryhmässä (28 % vs. 17 %, p = 0,01). He havaitsivat myös, että Il-1 alfan (-889T) alleelifrekvenssi oli korkeampi normaaleissa kontrolleissa kuin POAG-ryhmässä rajamerkityksyydellä (39 % vs. 29 %, p = 0,06). Tämä voi osoittautua merkittäväksi suuremmalla otoskoolla.

Tässä projektissa toivomme selvittävämme, suojaavatko valkoihoisilla Il-1-geeniklusterin polymorfismit myös aasialaispopulaatioiden glaukoomapotilaita. Pyrimme myös selvittämään, onko Il-1-geeniklusterin polymorfismien jakautumisessa normotensiivisillä glaukoomapotilailla eroja korkeapaineglaukoomapotilaisiin verrattuna. Tutkimuksessa tutkitaan sekä primaarisen sulkukulman että primaarisen avokulmaglaukoomapotilaita. Tutkimus on ensimmäinen, joka tutkii tällaisia ​​muutoksia PACG:ssä, joka on Aasian suurin sokeuden syy ja jota pidetään silmänpaineesta riippuvaisena sairautena. Tutkimustuloksilla voi olla vaikutuksia glaukooman geneettiseen perustaan, ja niissä keskitytään immuunijärjestelmän rooliin silmänpainevasteessa ja glaukooman patogeneesissä. Tämä on pilottitutkimus immuunijärjestelmään liittyvien polymorfismien roolista, ja tuloksista riippuen voimme aloittaa laajemman tutkimuksen muiden immuunigeenien roolista glaukoomassa.

menetelmät

Potilaiden rekrytointi:

Vähintään 300 primaarista glaukoomaa sairastavaa potilasta rekrytoidaan tutkimukseen Singaporen kansallisen silmäkeskuksen glaukoomaklinikoilta. Tämä koostuu PACG-, POAG- ja NTG-potilaista. Muita 100 verrokkipotilasta, joilla ei ole kliinistä näyttöä glaukoomasta, palkataan yleisklinikoista. Henkilöt, joilla on toissijainen kulman sulkeutuminen ja muut silmäsairaudet, suljetaan pois.

Potilaan arviointi ja tutkimus Molempien silmien tutkimukseen kuuluu parhaiten korjattu Snellenin näöntarkkuus, gonoskopia, silmänpaineen mittaus Goldmannin applanaatiotonometrillä, etuosan, linssin, lasiaisen ja verkkokalvon rakolamppututkimus. Lisäksi optisen levyn kuvaamiseen kaikissa kohteissa käytetään pyyhkäisevää laseroftalmoskooppia, Heidelbergin verkkokalvotomografia (HRT, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Saksa). Globaalit ja segmentoidut levy- ja kuppialueet analysoidaan suoraan HRT-ohjelmiston (versio 2.01b) avulla käyttäen standardia vertailutasoa. Vanteen pinta-ala lasketaan vähentämällä kupin pinta-ala kiekon pinta-alasta. Glaukooman vakavuus luokitellaan globaalien indeksien perusteella näkökentissä sekä hormonikorvaushoidon neuroretinaalisen reuna-alueen mukaan. Aksiaalinen pituus mitataan myös IOL-Masterilla (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Saksa). Jokaiselta potilaalta otetaan venepunktiolla 10 ml verta.

Glaukooman standardoituja sisällyttämistä koskevia kriteerejä käytetään, mikä tarkoittaa glaukomatoottisen optisen neuropatian esiintymistä (määritelty neuroretinaalisen reunan menetykseksi kuppi:levy-suhteella 0,7 tai suurempi) ja yhteensopivan näkökentän menetyksen. PACG määritellään vähintään 180 asteen kulman läsnäoloksi, jossa trabekulaarinen verkko ei ole näkyvissä gonioskopiassa ja jossa esiintyy glaukomatoottista optista neuropatiaa. POAG-potilailla on avoimet kulmat gonioskopiassa; POAG-potilaat, joiden keskimääräinen silmänpaine ilman hoitoa on jatkuvasti alle 21 mmHg vuorokausitesteissä, luokitellaan NTG:ksi.

DNA:n valmistelu ja genotyypitys

Genominen DNA uutetaan perifeerisen veren leukosyyteistä käyttämällä Nucleon DNA Extraction -pakkauksia. Il-1 alfa (-889), Il-beta (-511) ja Il-1beta (+3953) variantit havaitaan spesifisellä polymeraasiketjureaktiolla (PCR) (käyttämällä taulukon 1 alukkeita), jota seuraa pilkkominen restriktiolla. entsyymi pilkkoutuu taulukossa 1 kuvatulla tavalla. Polymorfismien varmistus suoritettaisiin suoralla sekvensoinnilla.

Metodologia on melko yksinkertainen, ja tohtori Alicia How (rekisteröijä, SNEC) voi suorittaa laboratoriotyön jokaviikkoisen tutkimusistunnon aikana. Tohtori How on käynyt perusmolekyyligenetiikan laboratoriokoulutuksen, ja häntä ohjaa tohtori Aung Tin.

Pöytä 1. Alukesekvenssi, PCR-olosuhteet ja entsyymi IL-1α:lle (-889), IL-1β:lle (-511) ja IL-1β:lle (+3953)

Polymorfismi Alukesekvenssi Hehkutuslämpötila (oC) Entsyymi Odotetut DNA-tuotteet (bp) IL-1alfa (-889) Eteenpäin 5'-GCATGCCATCACACCTAGTT-3' 58 Nco1 C:194 Käänteinen 5'-TTACATATGAGCCTTCCATG-3' T:178 1beta (-511) Eteenpäin 5'-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3' 60 Bsu36I, C:304 Käänteinen 5'-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3' T:190,114 IL-1beta (+3953) Eteenpäin 5'-GTTTCATCAI, GACTGTTGATCAI, GACTGTCATC0 135 114 Käänteinen 5'-TTCAGTTCATATGGACCAGA-3' T:249