Papel dos polimorfismos no cluster do gene IL-1

Mira:

Objetivo primário: Investigar se os polimorfismos no cluster de genes Il-1 são protetores para o glaucoma em populações asiáticas.

Objetivo secundário: Determinar se há diferenças nos polimorfismos de nucleotídeo único do cluster do gene Il-1 em pacientes com glaucoma normotenso versus pacientes com glaucoma de pressão alta.

Fundo

Os glaucomas são um grupo de neuropatias ópticas heterogêneas caracterizadas por perda progressiva de axônios no nervo óptico. Com base no Banco Global de Dados sobre Cegueira da OMS, o glaucoma é responsável por 5,1 milhões dos estimados 38 milhões de cegos no mundo.1Glaucoma afeta aproximadamente 70 milhões de pessoas no mundo e é a principal causa de cegueira irreversível no mundo2. À medida que o número de idosos no mundo aumenta rapidamente, a morbidade do glaucoma aumentará, causando aumento dos custos com saúde e ônus econômico. Isso tem implicações importantes na saúde pública para uma condição na qual a perda visual, uma vez estabelecida, não pode ser revertida. O principal fator de risco no glaucoma é a pressão intraocular elevada devido à redução do fluxo aquoso.

Estudos anteriores mostraram que o glaucoma é uma das principais causas de morbidade visual em Cingapura3-5. Em uma pesquisa de base populacional realizada em cingapurianos chineses no distrito de Tanjong Pagar, a prevalência de glaucoma padronizada por idade foi de 3,2% (intervalo de confiança de 95%, 2,3-4,1) na população de 40 anos ou mais.3

O glaucoma tem uma base genética importante, estimada em um terço (intervalo de 20 a 60%) de todos os casos de glaucoma, 6-8, embora um relatório recente sugira que isso seja subestimado.9 A heterogeneidade genética é ilustrada pelos mais de 15 loci e 7 genes causadores de glaucoma identificados até o momento, 10 incluindo 2 genes identificados para GPAA.11-12 Verificou-se que uma grande variedade de mecanismos genéticos induzem glaucomas de ângulo aberto e de desenvolvimento e estes incluem mutações de codificação, particularmente em fatores de transcrição, 13 dosagem genética alterada14 e efeitos negativos dominantes.15

A interleucina-1 é um importante mediador da inflamação. Existem 2 citocinas pró-inflamatórias, Il-1 alfa e Il-1 beta. Ambos são produzidos por monócitos, macrófagos e células epiteliais como respostas do hospedeiro à lesão tecidual. Os genes que codificam Il-1 estão localizados em uma região de 430kb no cromossomo 2q14.216. Polimorfismos do agrupamento de genes Il-1 demonstraram alterar a expressão de proteínas. Polimorfismos de nucleotídeo único têm sido associados a outras doenças, como pré-eclâmpsia, entre outras condições médicas17.

_A expressão da molécula de adesão leucocitária endotelial-1 (ELAM-1) nas células da malha trabecular foi identificada como um marcador diagnóstico de glaucoma18. _A expressão de ELAM-1 é controlada pela ativação do loop de feedback autócrino de Il-1, que é controlado pelo fator de transcrição NF-Kappa -Beta. Foi demonstrado que a Il-1 produzida endogenamente por células glaucomatosas inibe a resposta apoptótica ao estresse oxidativo18. Também foi relatado que a IL-1 aumenta a facilidade de escoamento estimulando a _expressão das enzimas metaloproteinases da matriz, que por sua vez reduz a resistência extracelular19-22. O efeito da Il-1 na síntese de óxido nítrico causando um relaxamento no tônus ​​da musculatura ciliar também pode contribuir para o aumento do fluxo aquoso23.

Recentemente, Wang et al mostraram que as variantes de Il-1 resultam em aumento da secreção de Il-1 e, portanto, reduzem o risco de glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA) 24. Isso foi apresentado na recente reunião ARVO 2005 na Flórida, EUA, sob o título "Novas idéias em glaucoma". O grupo liderado pela Dra. Elizabeth Fini, do Bascom Palmer Eye Institute, Miami, identificou variantes genéticas (+3953T) do Il-1 β, que é um fator protetor contra o GPAA. Eles avaliaram o DNA genômico de 100 pacientes com GPAA e 104 controles normais na população caucasiana ao longo de 40 anos. A frequência alélica de Il-1 Beta (+3953T) foi significativamente maior em controles normais do que no grupo GPAA (28% versus 17%, p=0,01). Eles também descobriram que a frequência do alelo de Il-1 alfa (-889T) foi maior em controles normais do que no grupo GPAA com significância limítrofe (39% versus 29%, p=0,06). Isso pode ser significativo com um tamanho de amostra maior.

Neste projeto, esperamos determinar se os polimorfismos no cluster de genes Il-1 encontrados nos caucasianos também são protetores para pacientes com glaucoma em populações asiáticas. Também pretendemos determinar se existem diferenças na distribuição de polimorfismos do cluster do gene Il-1 em pacientes com glaucoma normotensos versus pacientes com glaucoma de pressão alta. Serão estudados pacientes com glaucoma primário de ângulo fechado e primário de ângulo aberto. O estudo será o primeiro a investigar essas alterações no PACG, uma das principais causas de cegueira na Ásia e considerada uma doença dependente da PIO. Os resultados do estudo podem ter implicações na base genética do glaucoma, colocando o foco no papel do sistema imunológico na resposta da PIO e na patogênese do glaucoma. Este é um estudo piloto do papel dos polimorfismos relacionados ao sistema imunológico e, dependendo dos resultados, podemos embarcar em uma investigação mais ampla do papel de outros genes imunes no glaucoma.

Métodos

Recrutamento de pacientes:

Pelo menos 300 pacientes com glaucoma primário serão recrutados para o estudo nas clínicas de glaucoma do Singapore National Eye Centre. Isso consistirá em pacientes PACG, GPAA e NTG. Haverá outros 100 pacientes de controle sem evidência clínica de glaucoma recrutados nas clínicas gerais. Serão excluídos indivíduos com fechamento angular secundário e outras doenças oculares.

Avaliação e exame do paciente O exame de ambos os olhos incluirá acuidade visual de Snellen com a melhor correção, gonicoscopia, medição da pressão intraocular por tonômetro de aplanação de Goldmann, exame com lâmpada de fenda do segmento anterior, cristalino, vítreo e retina. Além disso, um oftalmoscópio de varredura a laser, o tomógrafo de retina de Heidelberg (HRT, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemanha) será usado para obter imagens do disco óptico em todos os indivíduos. As áreas global e segmentar do disco e da escavação serão analisadas diretamente por meio do software HRT (versão 2.01b) utilizando o plano de referência padrão. A área da borda será calculada subtraindo a área do copo da área do disco. A gravidade do glaucoma será classificada por índices globais nos campos visuais, bem como pela área da borda neurorretiniana HRT. O comprimento axial também será medido com o IOL-Master (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Alemanha). Serão obtidos 10 ml de sangue de cada paciente por punção venosa.

Serão utilizados critérios de inclusão padronizados para glaucoma, que é a presença de neuropatia óptica glaucomatosa (definida como perda da borda neurorretiniana com uma relação escavação:disco de 0,7 ou superior) com perda de campo visual compatível. PACG será definido como a presença de pelo menos 180 graus de ângulo em que a malha trabecular não é visível na gonioscopia com a presença de neuropatia óptica glaucomatosa. Os pacientes com GPAA terão ângulos abertos na gonioscopia; Pacientes com GPAA com PIO média sem tratamento consistentemente inferior a 21 mm Hg em testes diurnos serão classificados como GTN.

Preparação de DNA e Genotipagem

O DNA genômico será extraído de leucócitos do sangue periférico utilizando os kits Nucleon DNA Extraction. As variantes Il-1alpha (-889), Il-beta (-511) e Il-1beta (+3953) serão detectadas por reação em cadeia da polimerase (PCR) específica (usando primers na Tabela 1), seguida de digestão com restrição digestões enzimáticas conforme descrito na Tabela 1. A confirmação dos polimorfismos seria realizada por sequenciamento direto.

A metodologia é bastante direta e o trabalho de laboratório pode ser realizado pela Dra. Alicia How (Registrar, SNEC) durante sua sessão de pesquisa semanal. O Dr. How passou por um treinamento básico em laboratório de genética molecular e será supervisionado pelo Dr. Aung Tin.

Tabela 1. Sequência de primer, condição de PCR e enzima para IL-1α (-889), IL-1β (-511) e IL-1β (+3953)

Polimorfismo Sequência do primer Temperatura de recozimento (oC) Enzima Produtos de DNA esperados (pb) IL-1alpha (-889) Forward 5'-GCATGCCATCACACCTAGTT-3' 58 Nco1 C:194 Reverse 5'-TTACATATGAGCCTTCCATG-3' T:178,16 IL- 1beta (-511) Direto 5'-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3' 60 Bsu36I, C:304 Reverso 5'-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3' T:190,114 IL-1beta (+3953) Direto 5'-GTTGTCATCAGACTTTGACC-3' 60 TaqI, C: 135.114 Reverso 5'-TTCAGTTCATATGGACCAGA-3' T:249