Papel de los polimorfismos en el grupo de genes de IL-1

Objetivos:

Objetivo principal: investigar si los polimorfismos en el grupo de genes Il-1 protegen contra el glaucoma en poblaciones asiáticas.

Objetivo secundario: Determinar si existen diferencias en los polimorfismos de un solo nucleótido del grupo del gen Il-1 en pacientes con glaucoma normotenso versus pacientes con glaucoma de alta presión.

Fondo

Los glaucomas son un grupo de neuropatías ópticas heterogéneas caracterizadas por la pérdida progresiva de axones en el nervio óptico. Según el Banco Mundial de Datos sobre la Ceguera de la OMS, el glaucoma representa 5,1 millones de los 38 millones de ciegos estimados en el mundo.1Glaucoma afecta aproximadamente a 70 millones de personas en todo el mundo y es la principal causa de ceguera irreversible en el mundo2. A medida que aumenta rápidamente el número de personas mayores en el mundo, la morbilidad del glaucoma aumentará, lo que provocará un aumento de los costos de atención médica y la carga económica. Esto tiene importantes implicaciones de salud pública para una condición en la que la pérdida visual, una vez establecida, no se puede revertir. El principal factor de riesgo en el glaucoma es la presión intraocular elevada debido a la reducción del flujo acuoso.

Estudios previos han demostrado que el glaucoma es una de las principales causas de morbilidad visual en Singapur3-5. En una encuesta poblacional realizada en chinos singapurenses en el distrito de Tanjong Pagar, se encontró que la prevalencia de glaucoma estandarizada por edad era del 3,2 % (intervalo de confianza del 95 %, 2,3-4,1) en la población de 40 años o más.3

El glaucoma tiene una base genética importante, se estima que representa un tercio (rango 20 - 60 %) de todos los casos de glaucoma, 6-8 aunque un informe reciente sugiere que se trata de una subestimación.9 La heterogeneidad genética se ilustra con más de 15 loci y 7 genes causantes de glaucoma identificados hasta la fecha, 10 incluidos 2 genes identificados para POAG.11-12 Se ha encontrado una variedad diversa de mecanismos genéticos para inducir glaucomas de desarrollo y de ángulo abierto, y estos incluyen mutaciones de codificación, particularmente en factores de transcripción, 13 dosis alterada de genes14 y efectos negativos dominantes.15

La interleucina-1 es un importante mediador de la inflamación. Hay 2 citocinas proinflamatorias, Il-1 alfa e Il-1 beta. Ambos son producidos por monocitos, macrófagos y células epiteliales como respuesta del huésped a la lesión tisular. Los genes que codifican Il-1 están ubicados dentro de una región de 430 kb en el cromosoma 2q14.216. Se ha demostrado que los polimorfismos del grupo de genes Il-1 alteran la expresión de proteínas. Los polimorfismos de un solo nucleótido se han relacionado con otras enfermedades, como la preeclampsia, entre otras afecciones médicas17.

_Se ha identificado que la expresión de la molécula de adhesión de leucocitos endoteliales-1 (ELAM-1) en las células de la malla trabecular es un marcador de diagnóstico de glaucoma18. _La expresión de ELAM-1 está controlada por la activación del bucle de retroalimentación autocrina Il-1, que está controlado a través del factor de transcripción NF-Kappa-Beta. Se ha demostrado que la Il-1 producida endógenamente por células glaucomatosas inhibe la respuesta apoptótica al estrés oxidativo18. También se ha informado que Il-1 aumenta la facilidad de salida al estimular la expresión de enzimas metaloproteinasas de matriz, lo que a su vez reduce la resistencia extracelular19-22. El efecto de la Il-1 sobre la síntesis de óxido nítrico, que provoca una relajación del tono del músculo ciliar, también puede contribuir al aumento del flujo acuoso23.

Recientemente, Wang et al han demostrado que las variantes de Il-1 dan como resultado una mayor secreción de Il-1 y, por lo tanto, reducen el riesgo de glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA) 24. Esto fue presentado en la reciente reunión de ARVO 2005 en Florida, EE. UU., bajo "Nuevas ideas en glaucoma". El grupo dirigido por la Dra. Elizabeth Fini del Bascom Palmer Eye Institute, Miami, identificó variantes genéticas (+3953T) del Il-1 β, que es un factor protector contra el GPAA. Evaluaron el ADN genómico de 100 pacientes con GPAA y 104 controles normales en la población caucásica durante 40 años. La frecuencia alélica de Il-1 Beta (+3953T) fue significativamente mayor en los controles normales que en el grupo POAG (28 % frente a 17 %, p=0,01). También encontraron que la frecuencia alélica de Il-1 alfa (-889T) era más alta en los controles normales que en el grupo de GPAA en el límite de significación (39 % frente a 29 %, p = 0,06). Esto puede resultar significativo con un tamaño de muestra más grande.

En este proyecto, esperamos determinar si los polimorfismos en el grupo de genes Il-1 que se encuentran en los caucásicos también protegen a los pacientes con glaucoma en las poblaciones asiáticas. También pretendemos determinar si existen diferencias en la distribución de polimorfismos del grupo de genes Il-1 en pacientes con glaucoma normotenso frente a pacientes con glaucoma de alta presión. Se estudiarán pacientes con glaucoma primario de ángulo cerrado y primario de ángulo abierto. El estudio será el primero en investigar dichos cambios en GPAC, una de las principales causas de ceguera en Asia y considerada una enfermedad dependiente de la PIO. Los hallazgos del estudio pueden tener implicaciones sobre la base genética del glaucoma, poniendo el foco en el papel del sistema inmunitario en la respuesta de la PIO y la patogénesis del glaucoma. Este es un estudio piloto de la función de los polimorfismos relacionados con el sistema inmunitario y, según los resultados, podemos embarcarnos en una investigación más amplia sobre la función de otros genes inmunitarios en el glaucoma.

Métodos

Reclutamiento de pacientes:

Se reclutarán al menos 300 pacientes con glaucoma primario en el estudio de las clínicas de glaucoma en el Centro Nacional del Ojo de Singapur. Esto consistirá en pacientes PACG, POAG y NTG. Habrá otros 100 pacientes de control sin evidencia clínica de glaucoma reclutados de las clínicas generales. Se excluirán las personas con ángulo cerrado secundario y otras enfermedades oculares.

Evaluación y examen del paciente El examen, de ambos ojos, incluirá la agudeza visual de Snellen mejor corregida, goniscopia, medición de la presión intraocular mediante tonómetro de aplanación de Goldmann, examen con lámpara de hendidura del segmento anterior, cristalino, vítreo y retina. Además, se utilizará un oftalmoscopio láser de barrido, el tomógrafo de retina Heidelberg (HRT, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemania) para obtener imágenes del disco óptico en todos los sujetos. Las áreas globales y segmentarias del disco y la copa se analizarán directamente mediante el software HRT (versión 2.01b) utilizando el plano de referencia estándar. El área del borde se calculará restando el área de la copa del área del disco. La gravedad del glaucoma se clasificará por índices globales en los campos visuales, así como por el área del borde neurorretiniano de la TRH. La longitud axial también se medirá con el IOL-Master (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Alemania). Se obtendrán 10 ml de sangre de cada paciente por venopunción.

Se utilizarán los criterios de inclusión estandarizados para el glaucoma, que es la presencia de neuropatía óptica glaucomatosa (definida como pérdida del anillo neurorretiniano con una relación copa:disco de 0,7 o mayor) con pérdida de campo visual compatible. El PACG se definirá como la presencia de al menos 180 grados de ángulo en el que la malla trabecular no es visible en la gonioscopia con presencia de neuropatía óptica glaucomatosa. Los pacientes con POAG tendrán ángulos abiertos en la gonioscopia; Los pacientes con GPAA con una PIO media sin tratamiento que sea sistemáticamente inferior a 21 mm Hg en las pruebas diurnas se clasificarán como NTG.

Preparación y genotipado de ADN

El ADN genómico se extraerá de los leucocitos de la sangre periférica utilizando los kits de extracción de ADN Nucleon. Las variantes Il-1alpha (-889), Il-beta (-511) e Il-1beta (+3953) se detectarán mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) específica (utilizando los cebadores de la Tabla 1), seguida de digestión con restricción. digeridos enzimáticos como se describe en la Tabla 1. La confirmación de polimorfismos se llevaría a cabo mediante secuenciación directa.

La metodología es bastante sencilla y el trabajo de laboratorio lo puede realizar la Dra. Alicia How (Registradora, SNEC) durante su sesión de investigación cada semana. El Dr. How ha recibido capacitación básica en el laboratorio de genética molecular y será supervisado por el Dr. Aung Tin.

Tabla 1. Secuencia de cebador, condición de PCR y enzima para IL-1α (-889), IL-1β (-511) e IL-1β (+3953)

Polimorfismo Secuencia del cebador Temperatura de hibridación (oC) Enzima Productos de ADN esperados (pb) IL-1alfa (-889) Directa 5'-GCATGCCATCACACCTAGTT-3' 58 Nco1 C:194 Inversa 5'-TTACATATGAGCCTTCCATG-3' T:178,16 IL- 1beta (-511) Adelante 5'-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3' 60 Bsu36I, C:304 Inversa 5'-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3' T:190,114 IL-1beta (+3953) Adelante 5'-GTTTGCATCAGACTTTGACC-3' 60 TaqI, C: 135,114 Inversa 5'-TTCAGTTCATATGGACCAGA-3' T:249