IL-1 유전자 클러스터에서 다형성의 역할

목표:

1차 목표: Il-1 유전자 클러스터의 다형성이 아시아 인구의 녹내장을 보호하는지 조사합니다.

2차 목표: 정상 혈압 녹내장 환자와 고압 녹내장 환자에서 Il-1 유전자 클러스터의 단일 뉴클레오티드 다형성에 차이가 있는지 확인합니다.

배경

녹내장은 시신경에서 축색 돌기의 진행성 손실을 특징으로 하는 이질적인 시신경병증 그룹입니다. WHO Global Data Bank on Blindness에 따르면 녹내장은 전 세계 약 3,800만 명의 실명자 중 510만 명을 차지합니다.1녹내장 전 세계적으로 약 7천만 명의 사람들에게 영향을 미치고 있으며 전 세계적으로 돌이킬 수 없는 실명의 주요 원인입니다2. 전 세계적으로 노인 인구가 급격히 증가함에 따라 녹내장 이환율이 증가하여 의료 비용과 경제적 부담이 증가할 것입니다. 이는 일단 확립된 시력 손실을 되돌릴 수 없는 상태에 대한 공중 보건에 중요한 영향을 미칩니다. 녹내장의 주요 위험 인자는 방수 유출 감소로 인한 안압 상승입니다.

이전 연구에서는 녹내장이 싱가포르에서 시각 이환율의 주요 원인인 것으로 나타났습니다3-5. 탄종 파가(Tanjong Pagar) 지역의 중국인 싱가포르인을 대상으로 실시한 인구 기반 조사에서 녹내장의 연령 표준화 유병률은 40세 이상 인구에서 3.2%(95% 신뢰 구간, 2.3-4.1)인 것으로 나타났습니다.3

녹내장은 모든 녹내장 사례의 3분의 1(범위 20 - 60%)을 차지하는 것으로 추정되는 주요 유전적 근거를 가지고 있습니다. 6-8 최근 보고서에서는 이것이 과소평가되었다고 제안합니다.9 유전적 이질성은 POAG에 대해 확인된 2개의 유전자를 포함하여 현재까지 확인된 15개 이상의 유전자좌와 7개의 녹내장 유발 유전자로 설명됩니다.11-12 개방각 및 발달성 녹내장을 유발하는 다양한 유전적 기전이 발견되었으며 여기에는 특히 전사 인자, 13 변경된 유전자 투여량14 및 우세한 부정적인 영향의 코딩 돌연변이가 포함됩니다.15

인터루킨-1은 염증의 중요한 매개체입니다. 2개의 전 염증성 사이토카인, Il-1 알파 및 Il-1 베타가 있습니다. 둘 다 조직 손상에 대한 숙주 반응으로서 단핵구, 대식세포 및 상피 세포에 의해 생성됩니다. Il-1을 암호화하는 유전자는 염색체 2q14.216의 430kb 영역 내에 위치합니다. Il-1 유전자 클러스터의 다형성은 protein_expression을 변경하는 것으로 나타났습니다. 단일 뉴클레오티드 다형성은 다른 의학적 상태 중에서 자간전증과 같은 다른 질병과 관련이 있습니다17.

_섬유주 세포에서 내피 백혈구 부착 분자-1(ELAM-1)의 발현이 녹내장의 진단 마커인 것으로 확인되었습니다18. _ELAM-1의 발현은 IL-1 자가분비 피드백 루프의 활성화에 의해 제어되며, 이는 전사 인자 NF-Kappa -Beta를 통해 제어됩니다. 녹내장 세포에 의해 내생적으로 생성된 Il-1이 산화 스트레스에 대한 세포사멸 반응을 억제하는 것으로 나타났습니다. Il-1은 또한 매트릭스 메탈로프로테이나제 효소의 발현을 자극하여 유출 시설을 증가시키는 것으로 보고되었으며, 이는 차례로 세포 외 저항을 감소시킵니다19-22. 섬모체 근긴장도를 이완시키는 산화질소 합성에 대한 IL-1의 효과도 방수 유출 증가에 기여할 수 있습니다23.

최근 Wang 등은 Il-1 변이체가 Il-1의 분비를 증가시켜 원발성 개방각 녹내장(POAG)의 위험을 감소시킨다는 것을 보여주었습니다 24. 이것은 최근 미국 플로리다에서 열린 2005년 ARVO 회의에서 "녹내장에 대한 새로운 아이디어"로 발표되었습니다. 마이애미에 있는 Bascom Palmer Eye Institute의 Elizabeth Fini 박사가 이끄는 그룹은 POAG에 대한 보호 인자인 Il-1 β의 유전적 변이(+3953T)를 확인했습니다. 그들은 40년 동안 100명의 POAG 환자와 백인 인구의 104명의 정상 대조군의 게놈 DNA를 평가했습니다. Il-1 베타의 대립유전자 빈도(+3953T)는 POAG 그룹보다 정상 대조군에서 유의하게 더 높았다(28% 대 17%, p=0.01). 그들은 또한 Il-1 알파(-889T)의 대립유전자 빈도가 경계선 유의성에서 POAG 그룹보다 정상 대조군에서 더 높다는 것을 발견했습니다(39% 대 29%, p=0.06). 이것은 더 큰 샘플 크기에서 중요한 것으로 판명될 수 있습니다.

이 프로젝트에서 우리는 백인에서 발견되는 Il-1 유전자 클러스터의 다형성이 아시아 인구의 녹내장 환자에게도 보호되는지 확인하기를 희망합니다. 우리는 또한 정상 혈압 녹내장 환자와 고압 녹내장 환자에서 Il-1 유전자 클러스터의 다형성 분포에 차이가 있는지 확인하는 것을 목표로 합니다. 일차 각 폐쇄 및 일차 개방 각 녹내장 환자 모두가 연구될 것입니다. 이번 연구는 아시아에서 실명의 주요 원인이자 IOP 의존성 질환으로 간주되는 PACG의 이러한 변화를 조사하는 최초의 연구다. 이 연구 결과는 녹내장의 유전적 기반에 영향을 미칠 수 있으며 안압 반응 및 녹내장 병인에서 면역 체계의 역할에 초점을 맞춥니다. 이것은 면역 체계 관련 다형성의 역할에 대한 파일럿 연구이며 결과에 따라 녹내장에서 다른 면역 유전자의 역할에 대한 더 큰 조사에 착수할 수 있습니다.

행동 양식

환자 모집:

원발성 녹내장 환자 300명 이상이 싱가포르 국립 안과 센터의 녹내장 클리닉에서 연구에 모집될 것입니다. 이것은 PACG, POAG 및 NTG 환자로 구성됩니다. 녹내장의 임상적 증거가 없는 또 다른 100명의 대조군 환자가 일반 클리닉에서 모집될 것입니다. 이차 각 폐쇄 및 기타 안구 질환이 있는 개인은 제외됩니다.

환자 평가 및 검사 두 눈의 검사에는 가장 잘 교정된 Snellen 시력, 고니스코피, Goldmann 압평 안압계에 의한 안압 측정, 전안부, 수정체, 유리체 및 망막의 세극등 검사가 포함됩니다. 또한, 스캐닝 레이저 검안경인 Heidelberg retina tomograph(HRT, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)를 사용하여 모든 피험자의 시신경 유두를 이미지화합니다. 표준 기준면을 사용하여 HRT 소프트웨어(버전 2.01b)를 통해 전역 및 분절 디스크와 컵 영역을 직접 분석합니다. 림 면적은 디스크 면적에서 컵 면적을 빼서 계산됩니다. 녹내장의 중증도는 HRT 신경망막 테두리 영역뿐만 아니라 시야의 글로벌 지수에 의해 분류될 것입니다. 축 길이는 IOL-Master(Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Germany)로도 측정됩니다. 정맥 천자에 의해 각 환자로부터 10ml의 혈액을 채취합니다.

녹내장에 대한 표준화된 포함 기준이 사용될 것이며, 녹내장 시신경병증(컵:디스크 비율이 0.7 이상인 신경망막 테두리의 손실로 정의됨)과 호환되는 시야 손실이 있는 경우입니다. PACG는 녹내장성 시신경병증의 존재와 함께 전방각경 검사에서 섬유주 메쉬워크가 보이지 않는 각도가 180도 이상 존재하는 것으로 정의됩니다. POAG 환자는 전방각경 검사에서 열린 각도를 갖게 됩니다. 주간 검사에서 일관되게 21mmHg 미만인 치료 없이 평균 IOP를 갖는 POAG 환자는 NTG로 분류됩니다.

DNA 준비 및 유전자형 분석

Nucleon DNA Extraction kit를 이용하여 말초혈액의 백혈구에서 Genomic DNA를 추출합니다. Il-1alpha(-889), Il-beta(-511) 및 Il-1beta(+3953) 변이체는 특정 중합효소 연쇄 반응(PCR)(표 1의 프라이머 사용)에 의해 검출된 후 제한적으로 분해됩니다. 표 1에 설명된 대로 효소 분해. 다형성의 확인은 직접 시퀀싱에 의해 수행됩니다.

방법론은 매우 간단하며 실험실 작업은 매주 연구 세션 동안 Alicia How 박사(Registrar, SNEC)가 수행할 수 있습니다. How 박사는 기본 분자 유전학 실험실 교육을 받았으며 Aung Tin 박사의 감독을 받게 됩니다.

1 번 테이블. IL-1α(-889), IL-1β(-511) 및 IL-1β(+3953)에 대한 프라이머 서열, PCR 조건 및 효소

다형성 프라이머 서열 어닐링 온도(oC) 효소 예상 DNA 산물(bp) IL-1alpha (-889) 정방향 5'-GCATGCCATCACACCTAGTT-3' 58 Nco1 C:194 역방향 5'-TTACATATGAGCCTTCCATG-3' T:178,16 IL- 1베타(-511) 정방향 5'-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3' 60 Bsu36I, C:304 역방향 5'-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3' T:190,114 IL-1베타(+3953) 정방향 5'-GTTGTCATCAGACTTTGACC-3' 60 TaqI, C: 135,114 역방향 5'-TTCAGTTCATATGGACCAGA-3' T:249