人間ボランティアにおける三日熱マラリア原虫のスポロゾイト攻撃モデルの再現性の評価

研究デザイン

ランダム化非盲検臨床試験は、マラリア未経験のボランティアにおける三日熱マラリア原虫スポロゾイト攻撃モデル、具体的には、感染性蚊刺され数とギムザ染色された濃厚な血液によって検出可能な特許性寄生虫血症発症の可能性との関係を標準化するために設計されました。スメア（TBS）。 研究は 2 つのステップに分けられました。 ステップ A は、ヒトへの接種に適した成熟三日熱マラリア原虫スポロゾイトを生成するように設計されました。ステップ B は、スポロゾイト攻撃の安全性と再現性を評価するように設計されました。 ステップ A では、TBS によって感染性三日熱マラリア原虫生殖母細胞が検出された患者を、コロンビアのカリとブエナベントゥラにある免疫研究所 (IDIV) の外来診療所から募集しました。 患者は 35 mL の全血を提供し、ボランティアの健康を脅かす可能性のある重複感染がないか検査されました。 その後、その血液をハマダラカに人工的に与えました。14 ステップ B では、マラリアに罹患していない被験者を 3 ± 1、6 ± 1、または 9 ± 1 匹の感染蚊に刺され、感染の発症前期間とその再現性を判定しました。

献血と血液の品質保証

EDTA バキュテナー チューブ (Becton Dickinson、ニュージャージー州フランクリン レイクス) を使用して、各感染患者から 35 mL の全血を採取し、2 つのアリコートに分割しました。15 mL のサンプルは蚊に給餌され、20 mL のサンプルは蚊に送られました。ポリメラーゼ連鎖反応によるマラリア原虫種（三日熱マラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、マラリア原虫）の確認を含む、一般的な感染病原体（ウイルス、細菌、寄生虫）のパネルの定期的なスクリーニングのためのヴァッレ・デル・リリクリニックの血液バンク（ PCR) (表 2).15 血液検査と人間のボランティアに対する直接蚊の餌付けの背後にある理論的根拠は、次の 2 つの前提に基づいています。1) 標準的な血液銀行検査は、輸血中に病原体が人から人に感染しないことを保証する安全手順として広く受け入れられています。 したがって、標準的な血液銀行スクリーニングによって三日熱マラリア原虫以外の病原体に対して陰性であると判定された血液サンプルは、蚊に刺されてもヒトからヒトに感染するのに十分安全であるはずです。 2) ハマダラカがマラリア原虫以外の病原体を媒介することは報告されていません。 研究の前に、私たちは広範な文献調査を実施し、ハマダラカによって伝播される可能性があり、攻撃にさらされるボランティアにとって脅威となる可能性のある潜在的な病原体について、ウイルス学、寄生虫学、昆虫学の米国とコロンビアの専門家に相談しました。 血液銀行のスクリーニングに含まれるものも含め、ハマダラカによって伝播される他の病原体はまだ報告されていないということでコンセンサスが得られました。 ただし、血液を注入した後に何らかの共感染が確認された場合、蚊はバイオセーフティ手順を使用して廃棄されました。

蚊の感染症

ハマダラカ属の蚊であるブエナベンチュラ株は、カリの IDIV の実験室条件下で約 10 年間飼育されています。 この蚊のコロニーは、定期的にスポロゾイトを生成したり 14,16 したり、マラリア感染を阻止する免疫の研究に使用されたりすることに成功しています。 ここでは、ブエナベンチュラで三日熱マラリア原虫感染血液（配偶子血症≧0.1%）を採取した後、2～3時間以内に蚊に餌を与えました。 15 mL の血液を室温、500 × g で 5 分間遠心分離し、血漿を除去し、細胞を RPMI 1640 培地 (Gibco Cell Culture Systems、Invitrogen、ニューヨーク州グランドアイランド) で 1 回洗浄しました。 寄生された赤血球を、赤十字血液バンクから入手したプールされたヒトAB非免疫補体不活化血清を用いてヘマトクリット50%に再構成し、ウォータージャケット膜を使用して4,000匹の雌蚊（生後3～4日）のロットを感染させるために使用した。前述したように、装置を 37°C で使用します。14 感染した蚊は、27 ± 1°C、相対湿度 82% の厳格な生物学的安全条件下で維持され、0.05% パラアミノ安息香酸を添加した糖液が提供されました。18 血粉を与えてから 7 ～ 8 日後に、餌を与えられた蚊のサンプルを解剖し、顕微鏡検査して中腸内のオーシストの存在を確認し、14 日目と 15 日目に唾液腺内のスポロゾイトの存在を評価しました。19 蚊の感染は、1+ (1 ～ 10 spz)、2+ (11 ～ 100 spz)、3+ (101 ～ 1000 spz)、および 4+ (> 1001 spz) に等級分けされました。7

スポロゾイトチャレンジ

提案された感染性刺咬量は、それぞれ 3 匹、6 匹、および 9 匹の蚊でした。 ただし、1 回の投与につきプラスまたはマイナス 1 口の範囲は許容されました。 したがって、1 回の刺咬で目標蚊量を達成する可能性を高めるために、スクリーンメッシュの箱 (7 × 7 × 7 cm) に 4 匹、7 匹、および 10 匹の蚊を入れました。 最小目標用量を完了しなかった参加者は、2回目の咬傷を受けました。 マラリアに罹患していないボランティア 18 人が 3 つのグループ (N = 6) の 1 つにランダムに割り当てられ、グループごとに、最小の咬傷数 (3 咬傷) から最大の咬傷数 (9 咬傷) まで暴露されました。 スポロゾイト攻撃は、IDIV の昆虫学ユニットの安全な部屋で、実験プロトコルに厳密に従って行われました。 ボランティアには、蚊の摂食に影響を与える可能性のある局所化学薬品（石鹸、消臭剤、香水など）を使用しないよう求められました。 蚊に前腕の屈筋側を 10 ～ 15 分間刺させましたが、これは完全な An に十分であると事前に判断されていました。 アルビマヌスの充血。 刺された後、すべての蚊を解剖して、血液粉およびスポロゾイトの存在を確認した。 顕微鏡で任意の数のスポロゾイト (> 1) が検出された場合、蚊は陽性とみなされます。 研究参加者は昆虫学部門で1時間観察され、8時間後に電話で追跡調査され、その後24時間後に再度検査を受けて攻撃に対する反応を評価した。

マラリアの診断と患者の追跡調査

チャレンジ後 7 日目以降、ボランティアは毎日フォローアップ訪問を受け、その間にマラリアの症状と徴候が評価され、TBS およびプラスモディウム PCR (後者は遡及的に実施) のために採血されました。

TBS は、指の穿刺によって収集された 50 μL の全血を使用して実行されました。全血は、約 1.5 平方 cm の長方形の領域に広げられ、新たに調製した 10% ギムザ染色で染色されました。20 スライドが陰性であるとみなされる前に、合計 300 の顕微鏡視野が検査されました。 TBSが陽性であることが判明した場合、300個の白血球の存在下で数えられた寄生虫の数を推定し、μLあたりの白血球数に従って絶対寄生虫血を計算することによって寄生虫血を定量化した。 塗抹標本は経験豊富な顕微鏡医によって読み取られ、TBS のランダムサンプルはマラリア対策プログラムの顕微鏡医によって品質管理を受けました。

参加者は、TBSによって寄生虫が検出されるとすぐに抗マラリア薬で治療されました。 治療は、クロロキン（1,500 mgのクロロキン塩基を分割用量で経口投与：最初に600 mg、その後24時間と48時間後に450 mgを投与）とプリマキン（15 mgを2回、1日1回、14日間投与）で構成されました。 ボランティアには、必要に応じて点滴、鎮痛剤、制吐剤が投与されました。 マラリアと一致する徴候および症状は臨床検査によって評価され、国立がん研究所 (NCI) の有害事象基準 (CTCAE) に従って重症度に応じて次のように 1 ～ 5 にグレード分けされました: グレード 1 = 低度、グレード 2 = 中度、グレード3 = 重篤、グレード 4 = 重篤、グレード 5 = 死亡。 そう痒症は 1 から 3 にグレード分けされました (1 = 軽度または局所的、2 = 強度または広範囲、および 3 = 強度または広範囲で日常生活活動に支障をきたす)。 共通の用語 AE の一致がないため、蚊刺された後の浮腫および紅斑については、「注射部位 / 血管外漏出の変化」に関する CTCAE v 3 からの適応を次のように使用しました。グレード 1 = 局所的な痛み / 浮腫および紅斑。グレード 2 = 炎症または静脈炎を伴う痛みまたは腫れ。グレード 3 = 潰瘍形成または壊死。 痛みはグレード 1 = 軽度で機能には支障がないとしてスコア付けされました。グレード 2 = 中等度の痛み (痛みまたは鎮痛剤により機能が妨げられているが、日常生活活動は妨げられていない)。グレード 3 = 重度の痛み (日常生活活動に重大な支障をきたす痛みまたは鎮痛)。

臨床検査

心電図を曇らせた臨床検査スクリーニングにより、チャレンジの1か月前と研究完了後のボランティアの健康状態が確認されました（表1）。 心電図で見つかった異常は除外基準とみなされました。 ヘモグロビン、白血球数、血小板数、総ビリルビンの検査を、チャレンジ後 11 日目と 53 日目に再度実施しました。

統計的手法

サンプルサイズ（グループあたり N = 6）は、二項仮定に基づいた合理的な確率で、よりまれなイベント（たとえば、個人の約 5% で発生するイベント）の発生を観察できる最小の個人数に基づいています。 全体のサンプル サイズが 18 であれば、まれなイベントでも検出するには十分です。 蚊に刺された量（刺咬量）の滴定が確立されました。まずは、感染を引き起こすために必要な最小数を恣意的に考慮した数から始めます。 発症前の期間と症状の持続期間は幾何平均として表されました。 グループ間の差異はクラスカル-ウォリス検定によって推定され、0.05 未満の P 値で統計的に有意であるとみなされました。