Plasmodium Vivaxin sporozoiittihaastemallin uusittavuuden arviointi vapaaehtoistyössä

Opintojen suunnittelu

Satunnaistettu, avoin kliininen tutkimus suunniteltiin standardoimaan P. vivax sporozoite -altistusmalli malariaa aiemmin saamattomilla vapaaehtoisilla, erityisesti tarttuvien hyttysten puremien lukumäärän ja Giemsa-värjätyn paksun veren havaittavissa olevan patentoidun loisen kehittymisen todennäköisyyden välillä. sively (TBS). Tutkimus jaettiin kahteen vaiheeseen. Vaihe A suunniteltiin tuottamaan kypsiä P. vivax -sporotsoiitteja, jotka soveltuvat inokuloitavaksi ihmisiin; ja vaihe B suunniteltiin arvioimaan sporotsoiittialtistuksen turvallisuutta ja toistettavuutta. Vaiheeseen A potilaat, joilla oli TBS:n havaitsemia tarttuvia P. vivax -sugusoluja, värvättiin Immunology Instituten (IDIV) poliklinikoista Calissa ja Buenaventurassa Kolumbiassa. Potilaat luovuttivat 35 ml kokoverta, joka seulottiin sellaisten rinnakkaisinfektioiden varalta, jotka saattoivat muodostaa uhan vapaaehtoisten terveydelle. Sen jälkeen veri syötettiin keinotekoisesti Anopheles-hyttysille.14 Vaiheessa B malariaan kuulumattomat henkilöt altistettiin 3 ± 1, 6 ± 1 tai 9 ± 1 tartunnan saaneen hyttysen puremille tartunnan esipatenttiajan ja sen toistettavuuden määrittämiseksi.

Verenluovutus ja veren laadunvarmistus

EDTA-vacutainer-putkia (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) käytettiin keräämään 35 ml kokoverta kustakin tartunnan saaneesta potilaasta, jotka jaettiin kahteen osaan: 15 ml:n näyte hyttysten ruokintaa varten ja 20 ml:n näyte, joka kuljetettiin Valle del Lili -klinikan veripankki yleisten tartuntatautien (virus-, bakteeri-, loisten) paneelin rutiiniseulontaa varten, mukaan lukien Plasmodium-lajien (P. vivax, P. falciparum, P. malariae) vahvistaminen polymeraasiketjureaktiolla ( PCR) (taulukko 2).15 Veritutkimuksen ja vapaaehtoisten hyttysten ruokkimisen perustelut perustuivat kahteen lähtökohtaan: 1) Normaali veripankkiseulonta on yleisesti hyväksytty turvallisuustoimenpiteenä, jolla varmistetaan, että verensiirron aikana ei tartu taudinaiheuttajia ihmisestä toiseen. Siksi verinäytteiden, jotka on määritetty negatiivisiksi muille patogeeneille kuin P. vivaxille tavanomaisella veripankkiseulonnalla, tulisi olla riittävän turvallisia siirrettäväksi ihmisestä toiseen hyttysen pureman kautta. 2) Anopheles-hyttysten ei ole raportoitu välittävän mitään muuta taudinaiheuttajaa kuin Plasmodiumia. Ennen tutkimusta teimme laajan bibliografisen haun ja konsultoimme yhdysvaltalaisia ​​ja kolumbialaisia ​​virologian, parasitologian ja entomologian asiantuntijoita mahdollisista taudinaiheuttajista, joita Anopheles saattaa levittää ja jotka voivat muodostaa uhan altistuneille vapaaehtoisille. Oli yksimielisyys siitä, että toistaiseksi ei ole raportoitu minkään muun patogeenin levittäneen Anopheles-hyttysiä, mukaan lukien veripankkiseulonnassa mukana olevat. Hyttyset kuitenkin heitettiin pois käyttämällä bioturvallisuusmenettelyä, jos veren ruokinnan jälkeen todettiin, että niillä oli rinnakkaisinfektio.

Hyttynen infektio

Anopheles albimanus mosquitoes Buenaventura -kanta, on kasvatettu laboratorio-olosuhteissa IDIV:ssä Calissa noin 10 vuoden ajan. Tätä hyttysyhdyskuntaa on käytetty menestyksekkäästi sporotsoiitien säännölliseen tuottamiseen14,16 ja malarian leviämistä estävää immuniteettia koskeviin tutkimuksiin.17 Täällä hyttysiä ruokittiin 2-3 tunnin kuluessa sen jälkeen, kun P. vivax -infektoitunut veri (gametosytemia ≥ 0,1 %) kerättiin Buenaventurassa. 15 ml verta sentrifugoitiin 500 x g:llä 5 minuuttia huoneenlämpötilassa, plasma poistettiin ja solut pestiin kerran RPMI 1640 -elatusaineella (Gibco Cell Culture Systems, Invitrogen, Grand Island, NY). Parasitisoidut punasolut palautettiin 50-prosenttiseksi hematokriittisiksi yhdistetyllä ihmisen AB:lla, joka ei ole immuuni, komplementilla inaktivoitu seerumi, joka oli saatu Punaisen Ristin veripankista, ja niitä käytettiin infektoimaan useita 4 000 naarashyttystä (3-4 päivän ikäisiä) käyttämällä vesivaippaista kalvoa. laitteisto 37 °C:ssa, kuten aiemmin on kuvattu.14 Tartunnan saaneita hyttysiä pidettiin tiukoissa bioturvallisuusolosuhteissa 27 ± 1 °C:ssa ja 82 %:n suhteellisessa kosteudessa ja annettiin sokeriliuosta, jota oli täydennetty 0,05 % paraaminobentsoehapolla.18 Ruokittujen hyttysten näytteet leikattiin ja tutkittiin mikroskooppisesti 7-8 päivää veriaterian jälkeen ookystien esiintymisen määrittämiseksi keskisuolessa ja päivinä 14 ja 15 sporotsoiittien esiintymisen arvioimiseksi sylkirauhasissa.19 Hyttysinfektiot luokiteltiin 1+ (1-10 spz), 2+ (11-100 spz), 3+ (101-1000 spz) ja 4+ (> 1001 spz).7

Sporozoiittihaaste

Ehdotettu tarttuva puremisannos oli 3, 6 ja 9 hyttystä, vastaavasti. Kuitenkin plus tai miinus yksi purema annosta kohti sallittiin. Siksi seulaverkkoiset laatikot (7 × 7 × 7 cm) täytettiin 4, 7 ja 10 hyttysellä, jotta niillä olisi paremmat mahdollisuudet saavuttaa tavoiteltu hyttysannos yhdellä puremiskierroksella. Osallistujat, jotka eivät saaneet vähimmäistavoiteannosta loppuun, joutuivat toiselle puremiskierrokselle. Kahdeksantoista malariaa sairastamatonta vapaaehtoista jaettiin satunnaisesti yhteen kolmesta ryhmästä (N = 6), ja heidät altistettiin ryhmittäin pienimmästä (3 puremaa) suurimpaan (9 puremaa) puremien määrään. Sporozoite-altistus suoritettiin tiukasti noudattaen kokeellista protokollaa suojatussa huoneessa IDIV:n entomologiayksikössä. Vapaaehtoisia pyydettiin olemaan käyttämättä paikallisia kemikaaleja (esim. saippuaa, deodoranttia, hajuvettä), jotka voisivat vaikuttaa hyttysten ruokkimiseen. Hyttysten annettiin purra kyynärvarren koukistuspuolta 10-15 minuutin ajan, mikä oli aiemmin määritetty riittäväksi täydelle An:lle. albimanuksen turvotus. Puremisen jälkeen kaikki hyttyset leikattiin verijauhon ja sporotsoiittien läsnäolon varmistamiseksi. Hyttysiä pidettiin positiivisina, jos mikä tahansa määrä sporotsoiitteja (> 1) havaittiin mikroskooppisesti. Tutkimuksen osallistujia tarkkailtiin 1 tunnin ajan entomologiayksikössä, jota seurattiin puhelimitse 8 tuntia myöhemmin ja tutkittiin uudelleen 24 tunnin kuluttua altistusvasteen arvioimiseksi.

Malarian diagnoosi ja potilaan seuranta

Altistuksen jälkeisestä päivästä 7 lähtien vapaaehtoisilla oli päivittäisiä seurantakäyntejä, joiden aikana arvioitiin malarian oireita ja merkkejä ja kerättiin verta TBS:ää ja Plasmodium PCR:ää varten (jälkimmäinen suoritettiin takautuvasti).

TBS suoritettiin käyttämällä 50 µl kokoverta, joka oli kerätty sormenpistolla ja joka levitettiin noin 1,5 neliöcm:n suorakaiteen muotoiselle alueelle ja värjättiin juuri valmistetulla 10 % Giemsa-värillä.20 Yhteensä 300 mikroskooppista kenttää tutkittiin ennen kuin objektilasia pidettiin negatiivisena. Kun TBS:n todettiin olevan positiivinen, parasitemia määritettiin kvantitatiivisesti arvioimalla laskettujen loisten lukumäärä 300 leukosyytin läsnä ollessa ja laskemalla absoluuttinen parasitemia leukosyyttimäärän per μl mukaan. Kokeneet mikroskoopit lukivat sivelynäytteet, ja malarian torjuntaohjelman mikroskooppi tarkasti satunnaisen TBS-näytteen.

Osallistujia hoidettiin malarialääkkeillä heti, kun TBS havaitsi loisia. Hoito koostui klorokiinista (1 500 mg klorokiiniemästä annettuna suun kautta jaettuna annoksina: 600 mg aluksi, jota seurasi 450 mg 24 ja 48 tunnin kuluttua) ja primakiinista (kaksi 15 mg annosta kerran päivässä 14 päivän ajan). Vapaaehtoisille annettiin suonensisäisiä nesteitä, kipulääkkeitä ja antiemeettejä tarpeen mukaan. Malariaan liittyvät merkit ja oireet arvioitiin kliinisellä tutkimuksella ja ne luokiteltiin 1–5 niiden vakavuuden mukaan National Cancer Instituten (NCI) haittatapahtumien kriteerien (CTCAE) mukaisesti seuraavasti: Grade 1 = Low, Grade 2 = Keskivaikea, Grade 3 = vakava, luokka 4 = vakava ja luokka 5 = kuolema. Kutina arvioitiin 1–3 (1 = lievä tai paikallinen; 2 = voimakas tai laajalle levinnyt; ja 3 = voimakas tai laajalle levinnyt ja häiritsee päivittäistä elämää). Koska ei ole yhteistä terminologiaa AE-sopimusta, hyttysen pureman jälkeisen turvotuksen ja punoituksen osalta käytettiin CTCAE v 3:n mukautusta "pistoskohdan/ekstravasaatiomuutoksille" seuraavasti: Aste 1 = paikallinen kipu/turvotus ja eryteema; Aste 2 = kipu tai turvotus, johon liittyy tulehdus tai flebiitti; Aste 3 = haavauma tai nekroosi. Kipu pisteytettiin asteena 1 = lievä, ei häiritse toimintaa; Aste 2 = kohtalainen kipu (kipu tai analgeetit, jotka häiritsevät toimintaa, mutta eivät häiritse jokapäiväistä elämää); Aste 3 = voimakas kipu (kipu tai analgeetit, jotka häiritsevät vakavasti jokapäiväistä elämää).

Kliiniset laboratoriotutkimukset

Kliininen laboratorioseulonta -sammussa elektrokardiogrammi vahvisti vapaaehtoisten terveydentilan 1 kuukausi ennen altistusta ja tutkimuksen päättymisen jälkeen (taulukko 1). Kaikki EKG:ssa havaitut poikkeavuudet katsottiin poissulkemiskriteeriksi. Hemoglobiinin, valkosolujen määrän, verihiutaleiden lukumäärän ja kokonaisbilirubiinin testit suoritettiin uudelleen päivinä 11 ja 53 altistuksen jälkeen.

Tilastolliset menetelmät

Otoskoko (N = 6 ryhmää kohti) perustui yksilöiden vähimmäismäärään, joka saisi havaita harvinaisempien tapahtumien (esim. tapahtumia, joita esiintyy noin 5 %:lla yksilöistä) esiintymistä kohtuullisella todennäköisyydellä binomiaalisen oletuksen perusteella. Kokonaisotoskoko 18 riittäisi havaitsemaan harvinaisetkin tapahtumat. Hyttysten puremien (puremisannosten) titraus vahvistettiin; alkaen mielivaltaisesti harkitusta vähimmäismäärästä, joka vaaditaan infektion aiheuttamiseksi. Prepatenttijaksot ja oireiden kesto ilmaistiin geometrisina keskiarvoina. Ryhmien väliset erot arvioitiin Kruskal-Wallis-testillä, ja niitä pidettiin tilastollisesti merkitsevinä P-arvoilla, jotka olivat alle 0,05.