Valutazione della riproducibilità di un modello di sfida sporozoite per Plasmodium Vivax in volontari umani

Progettazione dello studio

È stato progettato uno studio clinico randomizzato in aperto per standardizzare un modello di sfida sporozoita di P. vivax in volontari naïve alla malaria, in particolare, la relazione tra il numero di punture di zanzara infettive e la probabilità di sviluppare una parassitemia rilevabile da sangue denso macchiato di Giemsa striscio (TBS). Lo studio è stato suddiviso in due fasi. Il passaggio A è stato progettato per produrre sporozoiti di P. vivax maturi adatti per l'inoculazione nell'uomo; e il passaggio B è stato progettato per valutare la sicurezza e la riproducibilità della sfida sporozoite. Per il passaggio A, i pazienti con gametociti infettivi di P. vivax rilevati da TBS sono stati reclutati dalle cliniche ambulatoriali dell'Istituto di immunologia (IDIV) a Cali e Buenaventura, in Colombia. I pazienti hanno donato 35 ml di sangue intero, che è stato sottoposto a screening per co-infezioni che potrebbero potenzialmente rappresentare una minaccia per la salute dei volontari. Il sangue è stato quindi somministrato artificialmente alle zanzare Anopheles.14 Per il passaggio B, i soggetti naive alla malaria sono stati esposti ai morsi di 3 ± 1, 6 ± 1 o 9 ± 1 zanzare infette per determinare il periodo prepatente dell'infezione e la sua riproducibilità.

Donazione di sangue e garanzia della qualità del sangue

Le provette vacutainer EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) sono state utilizzate per raccogliere 35 mL di sangue intero da ciascun paziente infetto, che sono stati divisi in due aliquote: un campione da 15 mL per l'alimentazione delle zanzare e un campione da 20 mL che è stato trasportato a la banca del sangue della Clinica Valle del Lili per lo screening di routine di un panel di agenti infettivi comuni (virali, batterici, parassitari), compresa la conferma di specie Plasmodium ( P. vivax, P. falciparum, P. malariae) mediante reazione a catena della polimerasi ( PCR) (Tabella 2).15 La logica alla base dello screening del sangue e dell'alimentazione diretta delle zanzare sui volontari umani si basava su due premesse: 1) lo screening standard della banca del sangue è universalmente accettato come procedura di sicurezza che garantisce che nessun agente patogeno venga trasmesso da uomo a uomo durante una trasfusione di sangue. Pertanto, i campioni di sangue determinati a essere negativi per agenti patogeni diversi da P. vivax mediante screening standard della banca del sangue dovrebbero essere sufficientemente sicuri da essere trasferiti da uomo a uomo attraverso una puntura di zanzara. 2) Non è stato riportato che le zanzare anofele trasmettano agenti patogeni diversi dal Plasmodium. Prima dello studio, abbiamo effettuato un'ampia ricerca bibliografica e consultato esperti statunitensi e colombiani di virologia, parassitologia ed entomologia sui potenziali agenti patogeni che potrebbero essere trasmessi da Anopheles e potrebbero rappresentare una minaccia per i volontari esposti alla sfida. C'era un consenso sul fatto che nessun altro patogeno fosse stato segnalato per essere trasmesso dalle zanzare Anopheles, comprese quelle comprese nello screening della banca del sangue. Tuttavia, le zanzare sono state scartate utilizzando una procedura di biosicurezza se dopo l'alimentazione del sangue è stata confermata la presenza di co-infezione.

Infezione da zanzara

Le zanzare Anopheles albimanus ceppo Buenaventura, sono state allevate in condizioni di laboratorio presso l'IDIV di Cali per circa 10 anni. Questa colonia di zanzare è stata utilizzata con successo per produrre regolarmente sporozoiti14,16 e per studi sull'immunità che blocca la trasmissione della malaria.17 Qui, le zanzare sono state alimentate entro 2-3 ore dopo che il sangue infetto da P. vivax (gametocitemia ≥ 0,1%) è stato raccolto a Buenaventura. Il sangue da 15 mL è stato centrifugato a 500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente, il plasma è stato rimosso e le cellule sono state lavate una volta con terreno RPMI 1640 (Gibco Cell Culture Systems, Invitrogen, Grand Island, NY). Gli eritrociti parassitati sono stati ricostituiti al 50% di ematocrito con un pool di siero umano AB non immune, inattivato dal complemento ottenuto dalla banca del sangue della Croce Rossa e sono stati usati per infettare lotti di 4.000 zanzare femmine (3-4 giorni) usando una membrana a camicia d'acqua apparecchio a 37°C, descritto in precedenza.14 Le zanzare infette sono state mantenute in rigorose condizioni di biosicurezza a 27 ± 1°C e umidità relativa dell'82% ed è stata fornita una soluzione zuccherina integrata con acido para-amminobenzoico allo 0,05%.18 Campioni di zanzare nutrite sono stati sezionati ed esaminati al microscopio 7-8 giorni dopo il pasto di sangue per determinare la presenza di oocisti nell'intestino medio e nei giorni 14 e 15 per valutare la presenza di sporozoiti nelle ghiandole salivari.19 Le infezioni da zanzare sono state classificate come 1+ (1-10 spz), 2+ (11-100 spz), 3+ (101-1000 spz) e 4+ (> 1001 spz).7

Sfida di sporozoiti

La dose di puntura infettiva proposta doveva essere rispettivamente di 3, 6 e 9 zanzare. Tuttavia, era consentito un intervallo di più o meno un morso per dose. Pertanto, le scatole a rete (7 × 7 × 7 cm) sono state riempite con 4, 7 e 10 zanzare, per avere maggiori possibilità di raggiungere la dose mirata di zanzara in un singolo giro di puntura. I partecipanti che non hanno completato la dose minima mirata sono stati sottoposti a un secondo ciclo di morsi. Diciotto volontari naïve alla malaria sono stati assegnati in modo casuale a uno dei tre gruppi (N = 6) e sono stati esposti per gruppo, dal numero minore (3 morsi) al numero maggiore (9 morsi) di morsi. La sfida con lo sporozoite è stata effettuata in stretta aderenza al protocollo sperimentale in una stanza sicura nell'unità di entomologia dell'IDIV. Ai volontari è stato chiesto di non utilizzare prodotti chimici topici (ad es. Sapone, deodorante, profumo) che potrebbero influire sull'alimentazione delle zanzare. Alle zanzare è stato permesso di mordere il lato flessore dell'avambraccio per un periodo di 10-15 minuti, precedentemente determinato come sufficiente per l'An completo. ingorgo albimano. Dopo aver morso, tutte le zanzare sono state sezionate per confermare la presenza di farina di sangue e sporozoiti. Le zanzare sono state considerate positive se un qualsiasi numero di sporozoiti (> 1) è stato rilevato al microscopio. I partecipanti allo studio sono stati osservati per 1 ora presso l'unità di entomologia, seguiti telefonicamente 8 ore dopo ed esaminati nuovamente 24 ore dopo per valutare la risposta alla sfida.

Diagnosi della malaria e follow-up del paziente

Dal giorno 7 post-challenge in poi, i volontari hanno effettuato visite di follow-up giornaliere durante le quali sono stati valutati i sintomi e i segni della malaria ed è stato raccolto il sangue per TBS e Plasmodium PCR (quest'ultimo eseguito in modo retrospettivo).

I TBS sono stati eseguiti utilizzando 50 μL di sangue intero prelevato mediante puntura del dito, distribuiti su un'area rettangolare di circa 1,5 cm2 e colorati con colorante Giemsa al 10% appena preparato.20 Un totale di 300 campi microscopici sono stati esaminati prima che un vetrino fosse considerato negativo. Quando il TBS è risultato positivo, la parassitemia è stata quantificata stimando il numero di parassiti contati in presenza di 300 leucociti e calcolando la parassitemia assoluta in base alla conta dei leucociti per μL. Gli strisci sono stati letti da microscopisti esperti e un campione casuale di TBS è stato sottoposto a controllo di qualità da un microscopista del programma di controllo della malaria.

I partecipanti sono stati trattati con farmaci antimalarici non appena i parassiti sono stati rilevati da TBS. Il trattamento consisteva in clorochina (1.500 mg di clorochina base forniti per via orale in dosi suddivise: 600 mg inizialmente seguiti da 450 mg somministrati 24 e 48 ore dopo) e primachina (due dosi da 15 mg somministrate una volta al giorno per 14 giorni). Ai volontari sono stati forniti fluidi per via endovenosa, analgesici e antiemetici secondo necessità. Segni e sintomi coerenti con la malaria sono stati valutati mediante esame clinico e sono stati classificati da 1 a 5 in base alla loro gravità seguendo i criteri per gli eventi avversi (CTCAE) del National Cancer Institute (NCI) come segue: Grado 1 = Basso, Grado 2 = Moderato, Grado 3 = Grave, Grado 4 = Grave e Grado 5 = Morte. Il prurito è stato valutato da 1 a 3 (1 = lieve o localizzato; 2 = intenso o diffuso; e 3 = intenso o diffuso e che interferisce con le attività della vita quotidiana). Poiché non esiste un accordo terminologico comune sugli AE, per l'edema e l'eritema in seguito a punture di zanzara, è stato utilizzato un adattamento dal CTCAE v 3 per "modifiche del sito di iniezione/stravaso" come segue: Grado 1 = dolore/edema locale ed eritema; Grado 2 = dolore o tumefazione con infiammazione o flebite; Grado 3 = ulcerazione o necrosi. Il dolore è stato valutato come Grado 1 = lieve che non interferisce con la funzione; Grado 2 = dolore moderato (dolore o analgesici che interferiscono con la funzione, ma non interferiscono con le attività della vita quotidiana); Grado 3 = dolore intenso (dolore o analgesici che interferiscono gravemente con le attività della vita quotidiana).

Test clinici di laboratorio

Lo screening clinico di laboratorio in presenza di un elettrocardiogramma ha confermato lo stato di salute dei volontari 1 mese prima del challenge e dopo il completamento dello studio (Tabella 1). Qualsiasi anomalia riscontrata nell'elettrocardiogramma è stata considerata come criterio di esclusione. I test per emoglobina, conta leucocitaria, conta piastrinica e bilirubina totale sono stati eseguiti nuovamente nei giorni 11 e 53 post-challenge.

metodi statistici

La dimensione del campione (N = 6 per gruppo) era basata sul numero minimo di individui a cui sarebbe stato consentito osservare il verificarsi di eventi più rari (ad esempio, eventi che si verificano in circa il 5% degli individui) con ragionevole probabilità basata su un presupposto binomiale. La dimensione complessiva del campione di 18 sarebbe sufficiente per rilevare anche eventi rari. È stata stabilita una titolazione delle punture di zanzara (dosi pungenti); a cominciare da quello arbitrariamente considerato il numero minimo necessario per provocare un'infezione. I periodi prepatenti e la durata dei sintomi sono stati espressi come medie geometriche. Le differenze tra i gruppi sono state stimate mediante il test di Kruskal-Wallis e sono state considerate statisticamente significative a valori P inferiori a 0,05.