Hodnocení reprodukovatelnosti modelu sporozoitové výzvy pro Plasmodium Vivax u lidských dobrovolníků

Studovat design

Randomizovaná, otevřená klinická studie byla navržena tak, aby standardizovala model provokace sporozoit P. vivax u dobrovolníků dosud neléčených malárií, konkrétně vztah mezi počtem infekčních kousnutí komáry a pravděpodobností rozvoje zjevné parazitémie detekovatelné hustou krví obarvenou Giemsou. stěr (TBS). Studie byla rozdělena do dvou kroků. Krok A byl navržen pro produkci zralých sporozoitů P. vivax vhodných pro inokulaci lidem; a Krok B byl navržen pro hodnocení bezpečnosti a reprodukovatelnosti sporozoitové čelenže. Pro krok A byli pacienti s infekčními gametocyty P. vivax detekovanými TBS přijati z ambulancí Immunology Institute (IDIV) v Cali a Buenaventura, Kolumbie. Pacienti darovali 35 ml plné krve, která byla vyšetřena na koinfekce, které by mohly představovat hrozbu pro zdraví dobrovolníků. Krev pak byla uměle krmena komárům rodu Anopheles.14 V kroku B byly malárií naivní subjekty vystaveny kousnutí 3 ± 1, 6 ± 1 nebo 9 ± 1 infikovaných komárů, aby se určilo prepatentní období infekce a její reprodukovatelnost.

Dárcovství krve a zajištění kvality krve

EDTA vakuové zkumavky (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) byly použity k odběru 35 ml plné krve od každého infikovaného pacienta, které byly rozděleny do dvou alikvotů: 15 ml vzorek pro krmení komárů a 20 ml vzorek, který byl transportován do krevní banka kliniky Valle del Lili pro rutinní screening na panel běžných infekčních agens (virové, bakteriální, parazitární), včetně potvrzení druhů Plasmodium (P. vivax, P. falciparum, P. malariae) polymerázovou řetězovou reakcí ( PCR) (tabulka 2).15 Zdůvodnění krevního screeningu a přímého krmení komárů na lidských dobrovolnících bylo založeno na dvou předpokladech: 1) standardní screening krevní banky je všeobecně přijímán jako bezpečnostní postup, který zajišťuje, že během krevní transfuze nebudou přenášeny žádné patogeny z člověka na člověka. Proto vzorky krve, které byly standardním screeningem krevní banky zjištěny jako negativní na jiné patogeny než P. vivax, by měly být dostatečně bezpečné, aby mohly být přeneseny z člověka na člověka kousnutím komárem. 2) U komárů rodu Anopheles nebylo hlášeno, že by přenášeli jiný patogen než Plasmodium. Před studií jsme provedli rozsáhlé bibliografické vyhledávání a konzultovali jsme s americkými a kolumbijskými odborníky na virologii, parazitologii a entomologii o potenciálních patogenech, které by mohly být přenášeny Anopheles a mohly by představovat hrozbu pro dobrovolníky vystavené napadení. Panovala shoda, že dosud nebyl hlášen žádný jiný patogen přenášený komáry rodu Anopheles, včetně těch, které jsou součástí screeningu krevní banky. Nicméně, komáři byli vyřazeni pomocí postupu biologické bezpečnosti, pokud bylo po krmení krví potvrzeno, že mají nějakou koinfekci.

Infekce komáry

Komáři Anopheles albimanus kmen Buenaventura byli chováni v laboratorních podmínkách v IDIV v Cali po dobu asi 10 let. Tato kolonie komárů byla úspěšně využívána k pravidelné produkci sporozoitů14,16 a pro studie imunity blokující přenos malárie.17 Zde byli komáři krmeni během 2-3 hodin poté, co byla v Buenaventura odebrána krev infikovaná P. vivax (gametocytémie ≥ 0,1 %). 15 ml krve bylo centrifugováno při 500 x g po dobu 5 minut při teplotě místnosti, plazma byla odstraněna a buňky byly jednou promyty médiem RPMI 1640 (Gibco Cell Culture Systems, Invitrogen, Grand Island, NY). Parazitované erytrocyty byly rekonstituovány na 50% hematokrit shromážděným lidským AB neimunitním, komplementem inaktivovaným sérem získaným z krevní banky Červeného kříže a byly použity k infekci 4 000 samic komárů (3-4 dny starých) pomocí membrány s vodním pláštěm. zařízení při 37 °C, popsané dříve.14 Infikovaní komáři byli udržováni za přísných podmínek biologické bezpečnosti při 27 ± 1 °C a relativní vlhkosti 82 % a byl poskytnut cukerný roztok doplněný 0,05 % para-aminobenzoové kyseliny.18 Vzorky krmených komárů byly vypreparovány a mikroskopicky vyšetřeny 7-8 dní po krevní moučce, aby se určila přítomnost oocyst ve středním střevě, a ve dnech 14 a 15 se vyhodnotila přítomnost sporozoitů ve slinných žlázách.19 Infekce komáry byly hodnoceny jako 1+ (1-10 spz), 2+ (11-100 spz), 3+ (101-1000 spz) a 4+ (> 1001 spz).7

Sporozoitová výzva

Navrhovaná dávka infekčního kousnutí měla být 3, 6 a 9 komárů. Byl však povolen rozsah plus minus jedno sousto na dávku. Krabice se síťovinou (7 × 7 × 7 cm) byly proto naplněny 4, 7 a 10 komáry, aby byla větší šance na dosažení cílené dávky komárů v jediném kole kousnutí. Účastníci, kteří nedosáhli minimální cílené dávky, byli podrobeni druhému kolu kousání. Osmnáct dobrovolníků dosud neléčených malárií bylo náhodně rozděleno do jedné ze tří skupin (N = 6) a byli vystaveni skupinám, od nejmenšího (3 kousnutí) po největší (9 kousnutí) počet kousnutí. Vyvolání sporozoitů bylo provedeno za přísného dodržování experimentálního protokolu v zabezpečené místnosti v entomologické jednotce v IDIV. Dobrovolníci byli požádáni, aby nepoužívali žádné lokální chemikálie (např. mýdlo, deodorant, parfém), které by mohly ovlivnit krmení komárů. Komárům bylo umožněno kousat flexorovou stranu předloktí po dobu 10 až 15 minut, dříve stanoveno jako dostatečné pro plnou An. albimanus přelití. Po kousnutí byli všichni komáři pitváni, aby se potvrdila přítomnost krevní moučky a sporozoitů. Komáři byli považováni za pozitivní, pokud byl mikroskopicky detekován jakýkoli počet sporozoitů (> 1). Účastníci studie byli pozorováni po dobu 1 hodiny na entomologické jednotce, následně telefonicky sledováni o 8 hodin později a znovu vyšetřeni o 24 hodin poté, aby se vyhodnotila reakce na výzvu.

Diagnostika malárie a sledování pacienta

Od 7. dne po provokaci měli dobrovolníci každodenní následné návštěvy, během kterých byly hodnoceny symptomy a příznaky malárie a byla odebrána krev pro TBS a Plasmodium PCR (poslední provedená retrospektivně).

TBS byly provedeny s použitím 50 μl plné krve odebrané píchnutím do prstu, které byly rozprostřeny na obdélníkovou plochu přibližně 1,5 cm2 a byly obarveny čerstvě připraveným 10% barvivem Giemsa.20 Než bylo sklíčko považováno za negativní, bylo prozkoumáno celkem 300 mikroskopických polí. Když byla TBS shledána pozitivní, parazitémie byla kvantifikována odhadem počtu parazitů napočítaných v přítomnosti 300 leukocytů a výpočtem absolutní parazitémie podle počtu leukocytů na μl. Nátěry byly odečítány zkušenými mikroskopy a náhodný vzorek TBS byl podroben kontrole kvality mikroskopem z programu pro kontrolu malárie.

Účastníci byli léčeni léky proti malárii, jakmile byly pomocí TBS detekovány parazity. Léčba sestávala z chlorochinu (1 500 mg chlorochinové báze podávané perorálně v rozdělených dávkách: 600 mg zpočátku následovaných 450 mg podaných o 24 a 48 hodin později) a primachinu (dvě 15 mg dávky podávané jednou denně po dobu 14 dnů). Dobrovolníkům byly podle potřeby poskytovány nitrožilní tekutiny, analgetika a antiemetika. Známky a symptomy odpovídající malárii byly hodnoceny klinickým vyšetřením a byly hodnoceny 1-5 podle jejich závažnosti podle kritérií National Cancer Institute (NCI) pro nežádoucí účinky (CTCAE) takto: stupeň 1 = nízký, stupeň 2 = střední, stupeň 3 = těžký, 4. stupeň = vážný a 5. stupeň = smrt. Svědění bylo hodnoceno od 1 do 3 (1 = mírné nebo lokalizované; 2 = intenzivní nebo rozšířené a 3 = intenzivní nebo rozšířené a narušující aktivity každodenního života). Protože neexistuje žádná společná terminologická shoda AE, pro edém a erytém po kousnutí komárem byla použita úprava z CTCAE v 3 pro „změny místa vpichu/extravasace“ následovně: Stupeň 1 = lokální bolest/edém a erytém; Stupeň 2 = bolest nebo otok se zánětem nebo flebitidou; Stupeň 3 = ulcerace nebo nekróza. Bolest byla hodnocena jako stupeň 1 = mírná, neinterferující s funkcí; Stupeň 2 = střední bolest (bolest nebo analgetika narušující funkci, ale nezasahující do činností každodenního života); Stupeň 3 = silná bolest (bolest nebo analgetika silně narušující aktivity každodenního života).

Klinické laboratorní testy

Klinický laboratorní screening na elektrokardiogramu potvrdil zdravotní stav dobrovolníků 1 měsíc před provokací a po dokončení studie (tabulka 1). Jakákoli abnormalita nalezená na elektrokardiogramu byla považována za vylučovací kritérium. Testy na hemoglobin, počet bílých krvinek, počet krevních destiček a celkový bilirubin byly znovu provedeny ve dnech 11 a 53 po provokaci.

statistické metody

Velikost vzorku (N = 6 na skupinu) byla založena na minimálním počtu jedinců, kterým by bylo umožněno pozorovat výskyt vzácnějších jevů (např. jevů, které se vyskytují přibližně u 5 % jedinců) s rozumnou pravděpodobností na základě binomického předpokladu. Celková velikost vzorku 18 by byla dostatečná pro detekci i vzácných událostí. Byla zavedena titrace kousnutí komárem (dávky kousnutí); počínaje tím, že se libovolně považuje za minimální požadovaný počet způsobující infekci. Prepatentní období a trvání symptomů byly vyjádřeny jako geometrické průměry. Rozdíly mezi skupinami byly odhadnuty Kruskal-Wallisovým testem a byly považovány za statisticky významné při hodnotách P nižších než 0,05.