Evaluering af reproducerbarhed af en sporozoit-udfordringsmodel for Plasmodium Vivax hos frivillige mennesker

Studere design

Et randomiseret, åbent klinisk forsøg blev designet til at standardisere en P. vivax sporozoite-udfordringsmodel i malaria-naive frivillige, specifikt forholdet mellem antallet af infektiøse myggestik og sandsynligheden for at udvikle patentparasitæmi, der kan påvises af Giemsa-farvet tykt blod udstrygning (TBS). Undersøgelsen var opdelt i to trin. Trin A blev designet til at producere modne P. vivax-sporozoiter, der er egnede til inokulering i mennesker; og Trin B blev designet til at vurdere sikkerheden og reproducerbarheden af ​​sporozoit-udfordringen. Til trin A blev patienter med infektiøse P. vivax-gametocytter påvist af TBS rekrutteret fra ambulatoriet på Immunology Institute (IDIV) i Cali og Buenaventura, Colombia. Patienter donerede 35 ml fuldblod, som blev screenet for samtidige infektioner, der potentielt kunne udgøre en trussel mod frivilliges helbred. Blodet blev derefter kunstigt fodret til Anopheles-myg.14 Til trin B blev malaria-naive forsøgspersoner udsat for bid af 3 ± 1, 6 ± 1 eller 9 ± 1 inficerede myg for at bestemme infektionens præpatentperiode og dens reproducerbarhed.

Bloddonation og blodkvalitetssikring

EDTA-vakutainerrørene (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) blev brugt til at opsamle 35 ml fuldblod fra hver inficeret patient, som blev opdelt i to portioner: en 15 ml prøve til myggefodring og en 20 ml prøve, der blev transporteret til blodbanken i Valle del Lili-klinikken til rutinemæssig screening for et panel af almindelige infektionsstoffer (virale, bakterielle, parasitære), herunder bekræftelse af Plasmodium-arter (P. vivax, P. falciparum, P. malariae) ved polymerasekædereaktion ( PCR) (tabel 2).15 Rationalet bag blodscreeningen og direkte myggefodring på frivillige mennesker var baseret på to præmisser: 1) standard blodbankscreening er universelt accepteret som en sikkerhedsprocedure, der sikrer, at ingen patogener overføres fra menneske til menneske under en blodtransfusion. Derfor bør blodprøver, der er fastslået som negative for andre patogener end P. vivax ved standard blodbankscreening, være sikre nok til at blive overført fra menneske til menneske gennem et myggestik. 2) Anopheles-myg er ikke blevet rapporteret at overføre andre patogener end Plasmodium. Før undersøgelsen udførte vi en omfattende bibliografisk søgning og rådførte os med amerikanske og colombianske eksperter i virologi, parasitologi og entomologi om potentielle patogener, der kunne overføres af Anopheles og kunne udgøre en trussel for de frivillige, der udsættes for udfordring. Der var konsensus om, at der endnu ikke er rapporteret om andre patogener, der overføres af Anopheles-myg, inklusive dem, der indgår i blodbankscreeningen. Imidlertid blev myg kasseret ved hjælp af en biosikkerhedsprocedure, hvis det efter fodring blev bekræftet, at blod havde en samtidig infektion.

Myggeinfektion

Anopheles albimanus myg Buenaventura stamme, er blevet opdrættet under laboratorieforhold på IDIV i Cali i omkring 10 år. Denne myggekoloni er med succes blevet brugt til regelmæssigt at producere sporozoitter14,16 og til undersøgelser af malaria-transmissionsblokerende immunitet.17 Her blev myg fodret inden for 2-3 timer efter det P. vivax-inficerede blod (gametocytæmi ≥ 0,1%) blev opsamlet i Buenaventura. 15 ml blod blev centrifugeret ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, plasma blev fjernet, og cellerne blev vasket én gang med RPMI 1640 medium (Gibco Cell Culture Systems, Invitrogen, Grand Island, NY). Parasitiserede erytrocytter blev rekonstitueret til 50 % hæmatokrit med poolet human AB ikke-immun, komplement-inaktiveret serum opnået fra Røde Kors blodbank og blev brugt til at inficere partier af 4.000 hunmyg (3-4 dage gamle) ved hjælp af en vandkappet membran apparat ved 37°C, beskrevet tidligere.14 Inficerede myg blev holdt under strenge biosikkerhedsbetingelser ved 27 ± 1°C og en relativ luftfugtighed på 82 %, og der blev leveret en sukkeropløsning suppleret med 0,05 % para-aminobenzoesyre.18 Prøver af fodrede myg blev dissekeret og mikroskopisk undersøgt 7-8 dage efter blodmåltidet for at bestemme tilstedeværelsen af ​​oocyster i mellemtarmen og på dag 14 og 15 for at vurdere tilstedeværelsen af ​​sporozoitter i spytkirtlerne.19 Myggeinfektioner blev klassificeret som 1+ (1-10 spz), 2+ (11-100 spz), 3+ (101-1000 spz) og 4+ (> 1001 spz).7

Sporozoite udfordring

Den foreslåede infektiøse biddosis skulle være henholdsvis 3, 6 og 9 myg. Imidlertid var et interval på plus eller minus en bid pr. dosis tilladt. Derfor blev skærmmaskede kasser (7 × 7 × 7 cm) fyldt med 4, 7 og 10 myg, for at have en bedre chance for at opnå den målrettede myggedosis i en enkelt biderunde. Deltagere, der ikke fuldførte den minimale målrettede dosis, blev udsat for en anden biderunde. Atten malaria-naive frivillige blev tilfældigt tildelt en af ​​tre grupper (N = 6) og blev eksponeret efter gruppe, fra det færreste (3 bid) til det største (9 bid) antal bid. Sporozoit-udfordring blev udført under streng overholdelse af eksperimentel protokol i et sikkert rum i entomologienheden på IDIV. Frivillige blev bedt om ikke at bruge aktuelle kemikalier (f.eks. sæbe, deodorant, parfume), der kunne påvirke myggefodring. Myg fik lov til at bide den bøjelige side af underarmen i en periode på 10 til 15 minutter, hvilket tidligere var bestemt til at være tilstrækkeligt til fuld An. albimanus oversvømmelse. Efter bidning blev alle myg dissekeret for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​blodmel og sporozoitter. Myg blev betragtet som positive, hvis et hvilket som helst antal sporozoitter (> 1) blev påvist mikroskopisk. Undersøgelsesdeltagere blev observeret i 1 time på entomologienheden, fulgt op på telefon 8 timer senere og undersøgt igen 24 timer derefter for at vurdere responsen på udfordring.

Malariadiagnose og patientopfølgning

Fra dag 7 efter udfordring og fremefter havde frivillige daglige opfølgningsbesøg, hvor symptomer og tegn på malaria blev vurderet, og blod blev indsamlet for TBS og Plasmodium PCR (sidstnævnte udført retrospektivt).

TBS blev udført ved hjælp af 50 μL fuldblod opsamlet ved fingerstik, der blev spredt over et rektangulært område på ca. 1,5 sq cm og blev farvet med frisklavet 10 % Giemsa-farve. I alt 300 mikroskopiske felter blev undersøgt, før et objektglas blev betragtet som negativt. Når TBS blev fundet positiv, blev parasitæmi kvantificeret ved at estimere antallet af parasitter talt i nærvær af 300 leukocytter og beregne absolut parasitæmi i henhold til leukocyttal pr. μL. Udstrygninger blev aflæst af erfarne mikroskopister, og en tilfældig prøve af TBS blev underkastet kvalitetskontrol af en mikroskopist fra malariakontrolprogrammet.

Deltagerne blev behandlet med anti-malariamedicin, så snart parasitter blev opdaget af TBS. Behandlingen bestod af chloroquin (1.500 mg chloroquinbase givet oralt i opdelte doser: 600 mg initialt efterfulgt af 450 mg givet 24 og 48 timer senere) og primaquin (to 15 mg doser givet én gang dagligt i 14 dage). Frivillige blev forsynet med intravenøs væske, analgetika og antiemetika efter behov. Tegn og symptomer i overensstemmelse med malaria blev vurderet ved klinisk undersøgelse og blev graderet 1-5 i henhold til deres sværhedsgrad efter National Cancer Institute (NCI) kriterier for bivirkninger (CTCAE) som følger: Grad 1 = Lav, Grad 2 = Moderat, Grade 3 = Alvorlig, Grad 4 = Alvorlig, og Grade 5 = Død. Kløe blev graderet fra 1 til 3 (1 = mild eller lokaliseret; 2 = intens eller udbredt; og 3 = intens eller udbredt og forstyrrer dagligdagens aktiviteter). Fordi der ikke er nogen fælles terminologi AE-overenskomst, for ødem og erytem efter myggestik, blev en tilpasning fra CTCAE v 3 for "injektionssted/ekstravasationsændringer" brugt som følger: Grad 1 = lokal smerte/ødem og erytem; Grad 2 = smerte eller hævelse med betændelse eller flebitis; Grad 3 = ulceration eller nekrose. Smerter blev scoret som Grad 1 = mild, der ikke forstyrrer funktionen; Grad 2 = moderat smerte (smerte eller analgetika, der forstyrrer funktionen, men ikke forstyrrer dagligdagens aktiviteter); Grad 3 = svær smerte (smerte eller smertestillende midler, der alvorligt forstyrrer dagligdagens aktiviteter).

Kliniske laboratorietests

Klinisk laboratoriescreening i skyggen af ​​et elektrokardiogram bekræftede frivilliges helbredsstatus 1 måned før udfordring og efter undersøgelsen var afsluttet (tabel 1). Enhver abnormitet fundet i elektrokardiogrammet blev betragtet som et eksklusionskriterium. Test for hæmoglobin, antal hvide blodlegemer, blodpladetal og total bilirubin blev udført igen på dag 11 og 53 efter belastningen.

Statistiske metoder

Prøvestørrelse (N = 6 pr. gruppe) var baseret på det mindste antal individer, der ville have lov til at observere forekomsten af ​​sjældnere hændelser (f.eks. hændelser, der forekommer hos ca. 5 % af individerne) med rimelig sandsynlighed baseret på en binomial antagelse. Den samlede prøvestørrelse på 18 ville være tilstrækkelig til at opdage selv sjældne hændelser. En titrering af myggestik (biddoser) blev etableret; begyndende med, at vilkårligt anses for det mindste antal, der kræves for at forårsage en infektion. Præpatente perioder og varighed af symptomer blev udtrykt som geometriske middelværdier. Forskelle mellem grupperne blev estimeret ved Kruskal-Wallis-testen og blev betragtet som statistisk signifikante ved P-værdier mindre end 0,05.