Bewertung der Reproduzierbarkeit eines Sporozoiten-Challenge-Modells für Plasmodium Vivax bei menschlichen Freiwilligen

Studiendesign

Eine randomisierte, offene klinische Studie wurde entwickelt, um ein P. vivax-Sporozoiten-Challenge-Modell bei Malaria-naiven Freiwilligen zu standardisieren, insbesondere den Zusammenhang zwischen der Anzahl infektiöser Mückenstiche und der Wahrscheinlichkeit der Entwicklung einer persistierenden Parasitämie, die durch Giemsa-gefärbtes dickes Blut nachweisbar ist Abstrich (TBS). Die Studie gliederte sich in zwei Schritte. Schritt A war darauf ausgelegt, reife P. vivax-Sporozoiten zu produzieren, die für die Inokulation in Menschen geeignet sind; und Schritt B wurde entwickelt, um die Sicherheit und Reproduzierbarkeit der Sporozoiten-Herausforderung zu bewerten. Für Schritt A wurden Patienten mit durch TBS nachgewiesenen infektiösen P. vivax-Gametozyten aus den Ambulanzen des Immunology Institute (IDIV) in Cali und Buenaventura, Kolumbien, rekrutiert. Die Patienten spendeten 35 ml Vollblut, das auf Koinfektionen untersucht wurde, die möglicherweise eine Gefahr für die Gesundheit der Freiwilligen darstellen könnten. Das Blut wurde dann künstlich an Anopheles-Mücken verfüttert.14 Für Schritt B wurden Malaria-naive Probanden den Stichen von 3 ± 1, 6 ± 1 oder 9 ± 1 infizierten Mücken ausgesetzt, um den Präpatenzzeitraum der Infektion und ihre Reproduzierbarkeit zu bestimmen.

Blutspende und Blutqualitätssicherung

Die EDTA-Vacutainer-Röhrchen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) wurden verwendet, um 35 ml Vollblut von jedem infizierten Patienten zu sammeln, die in zwei Aliquots aufgeteilt wurden: eine 15-ml-Probe zur Mückenfütterung und eine 20-ml-Probe, die transportiert wurde die Blutbank der Valle del Lili-Klinik zum routinemäßigen Screening auf eine Reihe häufiger Infektionserreger (viral, bakteriell, parasitär), einschließlich der Bestätigung von Plasmodium-Arten (P. vivax, P. falciparum, P. malariae) durch Polymerase-Kettenreaktion ( PCR) (Tabelle 2).15 Der Grundgedanke hinter dem Blutscreening und der direkten Mückenfütterung an freiwilligen Probanden basierte auf zwei Prämissen: 1) Das standardmäßige Screening von Blutbanken wird allgemein als Sicherheitsverfahren akzeptiert, das sicherstellt, dass bei einer Bluttransfusion keine Krankheitserreger von Mensch zu Mensch übertragen werden. Daher sollten Blutproben, die bei einem Standard-Blutbank-Screening als negativ für andere Krankheitserreger als P. vivax ermittelt wurden, sicher genug sein, um durch einen Mückenstich von Mensch zu Mensch übertragen zu werden. 2) Es wurde nicht berichtet, dass Anopheles-Mücken andere Krankheitserreger als Plasmodium übertragen. Vor der Studie führten wir eine umfassende bibliografische Suche durch und berieten uns mit US-amerikanischen und kolumbianischen Experten für Virologie, Parasitologie und Entomologie über potenzielle Krankheitserreger, die von Anopheles übertragen werden könnten und eine Bedrohung für die Freiwilligen darstellen könnten, die dem Virus ausgesetzt waren. Es bestand Einigkeit darüber, dass bisher keine anderen Erreger, einschließlich der im Blutbank-Screening erfassten, durch Anopheles-Mücken übertragenen Krankheitserreger gemeldet wurden. Allerdings wurden die Mücken mithilfe eines Biosicherheitsverfahrens verworfen, wenn nach der Blutfütterung bestätigt wurde, dass sie eine Koinfektion hatten.

Mückeninfektion

Anopheles albimanus-Mücken vom Stamm Buenaventura werden seit etwa 10 Jahren unter Laborbedingungen bei IDIV in Kalifornien gezüchtet. Diese Mückenkolonie wurde erfolgreich zur regelmäßigen Produktion von Sporozoiten14,16 und für Studien zur Malariaübertragungsblockierenden Immunität eingesetzt.17 Hier wurden die Mücken innerhalb von 2–3 Stunden nach der Sammlung des mit P. vivax infizierten Blutes (Gametozytenämie ≥ 0,1 %) in Buenaventura gefüttert. Die 15 ml Blut wurden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 500 × g zentrifugiert, das Plasma wurde entfernt und die Zellen wurden einmal mit RPMI 1640-Medium (Gibco Cell Culture Systems, Invitrogen, Grand Island, NY) gewaschen. Parasitierte Erythrozyten wurden mit gepooltem humanem, nicht-immunem, Komplement-inaktiviertem AB-Serum aus der Blutbank des Roten Kreuzes auf 50 % Hämatokrit rekonstituiert und zur Infektion von Gruppen von 4.000 weiblichen Mücken (3–4 Tage alt) mithilfe einer wasserummantelten Membran verwendet Gerät bei 37°C, wie zuvor beschrieben.14 Infizierte Mücken wurden unter strengen Biosicherheitsbedingungen bei 27 ± 1 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 82 % gehalten und es wurde eine mit 0,05 % para-Aminobenzoesäure ergänzte Zuckerlösung bereitgestellt.18 Proben von gefütterten Mücken wurden 7–8 Tage nach der Blutmahlzeit präpariert und mikroskopisch untersucht, um das Vorhandensein von Oozysten im Mitteldarm zu bestimmen, und an den Tagen 14 und 15, um das Vorhandensein von Sporozoiten in den Speicheldrüsen zu beurteilen.19 Mückeninfektionen wurden als 1+ (1–10 spz), 2+ (11–100 spz), 3+ (101–1000 spz) und 4+ (> 1001 spz) eingestuft.7

Sporozoiten-Herausforderung

Die vorgeschlagene infektiöse Stechdosis sollte 3, 6 bzw. 9 Mücken betragen. Allerdings war ein Bereich von plus oder minus einem Bissen pro Dosis zulässig. Daher wurden Siebkästen (7 × 7 × 7 cm) mit 4, 7 und 10 Mücken gefüllt, um eine bessere Chance zu haben, die angestrebte Mückendosis in einem einzigen Stechdurchgang zu erreichen. Teilnehmer, die die minimale Zieldosis nicht erreichten, wurden einer zweiten Bissrunde ausgesetzt. Achtzehn Malaria-naive Freiwillige wurden nach dem Zufallsprinzip einer von drei Gruppen (N = 6) zugeteilt und nach Gruppen exponiert, von der geringsten (3 Bisse) bis zur höchsten (9 Bisse) Anzahl an Bissen. Die Sporozoiten-Provokation wurde unter strikter Einhaltung des Versuchsprotokolls in einem sicheren Raum in der Entomologie-Abteilung des IDIV durchgeführt. Die Freiwilligen wurden gebeten, keine topischen Chemikalien (z. B. Seife, Deodorant, Parfüm) zu verwenden, die die Nahrungsaufnahme der Mücken beeinträchtigen könnten. Den Mücken wurde erlaubt, die Beugeseite des Unterarms für einen Zeitraum von 10 bis 15 Minuten zu beißen, was zuvor als ausreichend für eine vollständige An-Darstellung angesehen wurde. Albimanus-Schwellung. Nach dem Stechen wurden alle Mücken seziert, um das Vorhandensein von Blutmehl und Sporozoiten zu bestätigen. Mücken galten als positiv, wenn mikroskopisch eine beliebige Anzahl von Sporozoiten (> 1) nachgewiesen wurde. Die Studienteilnehmer wurden eine Stunde lang in der Entomologie-Abteilung beobachtet, acht Stunden später telefonisch nachverfolgt und 24 Stunden danach erneut untersucht, um die Reaktion auf die Herausforderung zu beurteilen.

Malariadiagnose und Patientennachsorge

Ab Tag 7 nach der Infektion hatten die Freiwilligen tägliche Nachuntersuchungen, bei denen die Symptome und Anzeichen von Malaria beurteilt und Blut für TBS und Plasmodium-PCR gesammelt wurde (letztere wurde retrospektiv durchgeführt).

Die TBS wurde mit 50 μl Vollblut durchgeführt, das durch Einstechen in den Finger gesammelt, über eine rechteckige Fläche von etwa 1,5 cm² verteilt und mit frisch zubereiteter 10 %iger Giemsa-Färbung gefärbt wurde.20 Insgesamt wurden 300 mikroskopische Felder untersucht, bevor ein Objektträger als negativ eingestuft wurde. Wenn TBS als positiv befunden wurde, wurde die Parasitämie quantifiziert, indem die Anzahl der in Gegenwart von 300 Leukozyten gezählten Parasiten geschätzt und die absolute Parasitämie anhand der Leukozytenzahl pro μL berechnet wurde. Die Abstriche wurden von erfahrenen Mikroskopikern untersucht und eine zufällige TBS-Probe wurde einer Qualitätskontrolle durch einen Mikroskopiker des Malariakontrollprogramms unterzogen.

Die Teilnehmer wurden mit Malariamedikamenten behandelt, sobald Parasiten durch TBS entdeckt wurden. Die Behandlung bestand aus Chloroquin (1.500 mg Chloroquinbase, oral verabreicht in geteilten Dosen: 600 mg anfänglich, gefolgt von 450 mg, verabreicht 24 und 48 Stunden später) und Primaquin (zwei 15-mg-Dosen, einmal täglich über 14 Tage verabreicht). Die Freiwilligen wurden bei Bedarf mit intravenösen Flüssigkeiten, Analgetika und Antiemetika versorgt. Anzeichen und Symptome im Zusammenhang mit Malaria wurden durch klinische Untersuchung beurteilt und entsprechend ihrer Schwere gemäß den Kriterien des National Cancer Institute (NCI) für unerwünschte Ereignisse (CTCAE) wie folgt mit 1–5 bewertet: Grad 1 = Niedrig, Grad 2 = Mittel, Grad 3 = Schwer, Grad 4 = Schwer und Grad 5 = Tod. Pruritus wurde mit einer Skala von 1 bis 3 bewertet (1 = leicht oder lokal begrenzt; 2 = intensiv oder weit verbreitet; und 3 = intensiv oder weit verbreitet und beeinträchtigt die Aktivitäten des täglichen Lebens). Da für Ödeme und Erytheme nach Mückenstichen keine einheitliche Terminologie (AE) besteht, wurde eine Anpassung aus CTCAE v 3 für „Änderungen der Injektionsstelle/Extravasation“ wie folgt verwendet: Grad 1 = lokaler Schmerz/Ödem und Erythem; Grad 2 = Schmerzen oder Schwellung mit Entzündung oder Venenentzündung; Grad 3 = Ulzeration oder Nekrose. Der Schmerz wurde als Grad 1 bewertet = leicht, ohne die Funktion zu beeinträchtigen; Grad 2 = mäßiger Schmerz (Schmerzen oder Analgetika beeinträchtigen die Funktion, beeinträchtigen jedoch nicht die Aktivitäten des täglichen Lebens); Grad 3 = starke Schmerzen (Schmerzen oder Analgetika beeinträchtigen die Aktivitäten des täglichen Lebens erheblich).

Klinische Labortests

Ein klinisches Labor-Screening mittels Eintrübung eines Elektrokardiogramms bestätigte den Gesundheitszustand der Freiwilligen einen Monat vor der Belastung und nach Abschluss der Studie (Tabelle 1). Als Ausschlusskriterium galt jede im Elektrokardiogramm festgestellte Anomalie. An den Tagen 11 und 53 nach der Belastung wurden erneut Tests auf Hämoglobin, weiße Blutkörperchen, Blutplättchen und Gesamtbilirubin durchgeführt.

statistische Methoden

Die Stichprobengröße (N = 6 pro Gruppe) basierte auf der Mindestanzahl von Personen, die das Auftreten seltenerer Ereignisse (z. B. Ereignisse, die bei etwa 5 % der Personen auftreten) mit angemessener Wahrscheinlichkeit auf der Grundlage einer Binomialannahme beobachten durften. Die Gesamtstichprobengröße von 18 würde ausreichen, um auch seltene Ereignisse zu erkennen. Es wurde eine Titration von Mückenstichen (Stechdosen) etabliert; Beginnend damit wird willkürlich die Mindestanzahl berücksichtigt, die eine Infektion auslöst. Präpatenzperioden und Dauer der Symptome wurden als geometrische Mittelwerte ausgedrückt. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch den Kruskal-Wallis-Test geschätzt und bei P-Werten unter 0,05 als statistisch signifikant angesehen.