Avaliação da Reprodutibilidade de um Modelo de Desafio de Esporozoítos para Plasmodium Vivax em Voluntários Humanos

Design de estudo

Um ensaio clínico randomizado e aberto foi projetado para padronizar um modelo de desafio de esporozoítos de P. vivax em voluntários virgens de malária, especificamente, a relação entre o número de picadas de mosquitos infecciosos e a probabilidade de desenvolver parasitemia patente detectável por sangue espesso corado com Giemsa esfregaço (TBS). O estudo foi dividido em duas etapas. A etapa A foi projetada para produzir esporozoítos maduros de P. vivax adequados para inoculação em humanos; e a Etapa B foi projetada para avaliar a segurança e a reprodutibilidade do desafio com esporozoítos. Para a Etapa A, pacientes com gametócitos infecciosos de P. vivax detectados por TBS foram recrutados nos ambulatórios do Instituto de Imunologia (IDIV) em Cali e Buenaventura, Colômbia. Os pacientes doaram 35 mL de sangue total, que foi testado para co-infecções que poderiam representar uma ameaça à saúde dos voluntários. O sangue foi então alimentado artificialmente com mosquitos Anopheles.14 Para a Etapa B, os indivíduos virgens de malária foram expostos às picadas de 3 ± 1, 6 ± 1 ou 9 ± 1 mosquitos infectados para determinar o período pré-patente da infecção e sua reprodutibilidade.

Doação de sangue e garantia da qualidade do sangue

Os tubos vacutainer EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) foram usados ​​para coletar 35 mL de sangue total de cada paciente infectado, que foram divididos em duas alíquotas: uma amostra de 15 mL para alimentação do mosquito e uma amostra de 20 mL que foi transportada para o banco de sangue da Clínica Valle del Lili para triagem de rotina para um painel de agentes infecciosos comuns (viral, bacteriano, parasitário), incluindo confirmação de espécies de Plasmodium ( P. vivax, P. falciparum, P. malariae) por reação em cadeia da polimerase ( PCR) (Tabela 2).15 A lógica por trás da triagem de sangue e da alimentação direta de mosquitos em voluntários humanos foi baseada em duas premissas: 1) a triagem padrão de banco de sangue é universalmente aceita como um procedimento de segurança que garante que nenhum patógeno seja transmitido de humano para humano durante uma transfusão de sangue. Portanto, as amostras de sangue consideradas negativas para outros patógenos além do P. vivax pela triagem padrão do banco de sangue devem ser seguras o suficiente para serem transferidas de humano para humano por meio de uma picada de mosquito. 2) Os mosquitos Anopheles não foram relatados como transmissores de qualquer patógeno além do Plasmodium. Antes do estudo, realizamos uma extensa pesquisa bibliográfica e consultamos especialistas americanos e colombianos em virologia, parasitologia e entomologia sobre possíveis patógenos que podem ser transmitidos por Anopheles e podem representar uma ameaça para os voluntários expostos ao desafio. Houve um consenso de que até agora nenhum outro patógeno havia sido relatado como sendo transmitido por mosquitos Anopheles, incluindo aqueles incluídos na triagem do banco de sangue. No entanto, os mosquitos foram descartados usando um procedimento de biossegurança se, após a alimentação com sangue, fosse confirmado qualquer co-infecção.

Infecção por mosquito

Os mosquitos Anopheles albimanus, da estirpe Buenaventura, são criados em condições de laboratório no IDIV em Cali há cerca de 10 anos. Esta colônia de mosquitos tem sido usada com sucesso para produzir regularmente esporozoítos14,16 e para estudos sobre a imunidade de bloqueio da transmissão da malária.17 Aqui, os mosquitos foram alimentados dentro de 2-3 horas depois que o sangue infectado com P. vivax (gametocytemia ≥ 0,1%) foi coletado em Buenaventura. Os 15 mL de sangue foram centrifugados a 500 × g por 5 minutos em temperatura ambiente, o plasma foi removido e as células foram lavadas uma vez com meio RPMI 1640 (Gibco Cell Culture Systems, Invitrogen, Grand Island, NY). Os eritrócitos parasitados foram reconstituídos a 50% de hematócrito com soro AB humano não imune e inativado do complemento obtido do banco de sangue da Cruz Vermelha e foram usados ​​para infectar lotes de 4.000 mosquitos fêmeas (3-4 dias de idade) usando uma membrana revestida com água aparelho a 37°C, descrito anteriormente.14 Os mosquitos infectados foram mantidos sob estritas condições de biossegurança a 27 ± 1°C e umidade relativa de 82% e uma solução de açúcar suplementada com 0,05% de ácido para-aminobenzóico foi fornecida.18 Amostras de mosquitos alimentados foram dissecadas e examinadas microscopicamente 7-8 dias após a refeição de sangue para determinar a presença de oocistos no intestino médio e nos dias 14 e 15 para avaliar a presença de esporozoítos nas glândulas salivares.19 As infecções por mosquitos foram classificadas como 1+ (1-10 spz), 2+ (11-100 spz), 3+ (101-1000 spz) e 4+ (> 1001 spz).7

desafio de esporozoítos

A dose de picada infecciosa proposta era de 3, 6 e 9 mosquitos, respectivamente. No entanto, foi permitido um intervalo de mais ou menos uma mordida por dose. Portanto, caixas de tela (7 × 7 × 7 cm) foram preenchidas com 4, 7 e 10 mosquitos, para ter uma melhor chance de atingir a dose alvo do mosquito em uma única rodada de picadas. Os participantes que não completaram a dose mínima alvo foram submetidos a uma segunda rodada de mordidas. Dezoito voluntários virgens de malária foram aleatoriamente designados para um dos três grupos (N = 6) e foram expostos por grupo, do menor (3 picadas) ao maior (9 picadas) número de picadas. O desafio de esporozoítos foi realizado sob estrita adesão ao protocolo experimental em uma sala segura na unidade de entomologia do IDIV. Os voluntários foram orientados a não usar nenhum produto químico tópico (por exemplo, sabonete, desodorante, perfume) que pudesse afetar a alimentação do mosquito. Os mosquitos foram autorizados a picar o lado flexor do antebraço por um período de 10 a 15 minutos, previamente determinado como suficiente para An completo. ingurgitamento albimanus. Após a picada, todos os mosquitos foram dissecados para confirmar a presença de repasto sanguíneo e esporozoítos. Os mosquitos foram considerados positivos se qualquer número de esporozoítos (> 1) fosse detectado microscopicamente. Os participantes do estudo foram observados por 1 hora na unidade de entomologia, seguidos por telefone 8 horas depois e examinados novamente 24 horas depois para avaliar a resposta ao desafio.

Diagnóstico da malária e acompanhamento do paciente

A partir do dia 7 pós-desafio, os voluntários tiveram visitas diárias de acompanhamento durante as quais os sintomas e sinais de malária foram avaliados e o sangue foi coletado para TBS e Plasmodium PCR (o último realizado retrospectivamente).

O TBS foi realizado usando 50 μL de sangue total coletado por picada no dedo que foram espalhados em uma área retangular de aproximadamente 1,5 cm2 e foram corados com coloração de Giemsa 10% recém-preparada.20 Um total de 300 campos microscópicos foram examinados antes que uma lâmina fosse considerada negativa. Quando o TBS foi positivo, a parasitemia foi quantificada estimando-se o número de parasitas contados na presença de 300 leucócitos e calculando-se a parasitemia absoluta de acordo com a contagem de leucócitos por μL. Os esfregaços foram lidos por microscopistas experientes e uma amostra aleatória de TBS foi submetida ao controle de qualidade por um microscopista do programa de controle da malária.

Os participantes foram tratados com medicamentos antimaláricos assim que os parasitas foram detectados pelo TBS. O tratamento consistiu em cloroquina (1.500 mg de base de cloroquina por via oral em doses divididas: 600 mg inicialmente seguido de 450 mg administrados 24 e 48 horas depois) e primaquina (duas doses de 15 mg administradas uma vez ao dia durante 14 dias). Os voluntários receberam fluidos intravenosos, analgésicos e antieméticos, conforme necessário. Sinais e sintomas consistentes com malária foram avaliados por exame clínico e foram classificados de 1 a 5 de acordo com sua gravidade seguindo os critérios do National Cancer Institute (NCI) para eventos adversos (CTCAE) como segue: Grau 1 = Baixo, Grau 2 = Moderado, Grau 3 = Grave, Grau 4 = Grave e Grau 5 = Óbito. O prurido foi classificado de 1 a 3 (1 = leve ou localizado; 2 = intenso ou generalizado; e 3 = intenso ou generalizado e interferindo nas atividades da vida diária). Como não há acordo de terminologia AE comum, para edema e eritema após picadas de mosquito, uma adaptação do CTCAE v 3 para "alterações no local de injeção/extravasamento" foi usada da seguinte forma: Grau 1 = dor/edema e eritema locais; Grau 2 = dor ou inchaço com inflamação ou flebite; Grau 3 = ulceração ou necrose. A dor foi classificada como Grau 1 = leve sem interferir na função; Grau 2 = dor moderada (dor ou analgésicos que interferem na função, mas não interferem nas atividades da vida diária); Grau 3 = dor intensa (dor ou analgésicos interferindo gravemente nas atividades da vida diária).

Exames laboratoriais clínicos

A triagem laboratorial clínica em -nublando um eletrocardiograma confirmou o estado de saúde dos voluntários 1 mês antes do desafio e após a conclusão do estudo (Tabela 1). Qualquer anormalidade encontrada no eletrocardiograma foi considerada como critério de exclusão. Testes para hemoglobina, contagem de glóbulos brancos, contagem de plaquetas e bilirrubina total foram realizados novamente nos dias 11 e 53 após o desafio.

Métodos estatísticos

O tamanho da amostra (N = 6 por grupo) foi baseado no número mínimo de indivíduos que seria permitido observar a ocorrência de eventos mais raros (por exemplo, eventos que ocorrem em aproximadamente 5% dos indivíduos) com probabilidade razoável com base em uma suposição binomial. O tamanho total da amostra de 18 seria suficiente para detectar até mesmo eventos raros. Uma titulação de picadas de mosquito (doses de picadas) foi estabelecida; começando com aquele considerado arbitrariamente o número mínimo necessário para causar uma infecção. Os períodos pré-patentes e a duração dos sintomas foram expressos em média geométrica. As diferenças entre os grupos foram estimadas pelo teste de Kruskal-Wallis, sendo consideradas estatisticamente significativas para valores de P menores que 0,05.