Ocena odtwarzalności modelu prowokacji sporozoitami dla Plasmodium Vivax u ochotników

Projekt badania

Randomizowane, otwarte badanie kliniczne zostało zaprojektowane w celu standaryzacji modelu prowokacji sporozoitami P. vivax u ochotników nie chorujących na malarię, w szczególności związku między liczbą ukąszeń zakaźnych komarów a prawdopodobieństwem rozwoju patentnej parazytemii wykrywalnej przez gęstą krew barwioną metodą Giemsy rozmaz (TBS). Badanie podzielono na dwa etapy. Etap A miał na celu wytworzenie dojrzałych sporozoitów P. vivax odpowiednich do zaszczepienia ludzi; a etap B miał na celu ocenę bezpieczeństwa i odtwarzalności prowokacji sporozoitami. W przypadku etapu A pacjenci z zakaźnymi gametocytami P. vivax wykrytymi przez TBS byli rekrutowani z ambulatoriów w Instytucie Immunologii (IDIV) w Cali i Buenaventura w Kolumbii. Pacjenci oddali 35 ml pełnej krwi, którą przebadano pod kątem koinfekcji, które mogłyby potencjalnie stanowić zagrożenie dla zdrowia ochotników. Krew była następnie sztucznie karmiona komarami Anopheles.14 W kroku B osoby nieleczone wcześniej malarią były narażone na ukąszenia 3 ± 1, 6 ± 1 lub 9 ± 1 zakażonych komarów w celu określenia okresu prepatentnego infekcji i jej odtwarzalności.

Oddawanie krwi i zapewnienie jakości krwi

Probówki próżniowe z EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) wykorzystano do pobrania 35 ml pełnej krwi od każdego zakażonego pacjenta, którą podzielono na dwie porcje: 15 ml próbkę do karmienia komarów i 20 ml próbkę, którą przetransportowano do bank krwi kliniki Valle del Lili do rutynowych badań przesiewowych w kierunku panelu powszechnych czynników zakaźnych (wirusowych, bakteryjnych, pasożytniczych), w tym potwierdzenia obecności gatunków Plasmodium (P. vivax, P. falciparum, P. malariae) za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy ( PCR) (Tabela 2).15 Uzasadnienie badania krwi i bezpośredniego karmienia ochotników przez komary opierało się na dwóch przesłankach: 1) standardowe badanie przesiewowe banku krwi jest powszechnie akceptowane jako procedura bezpieczeństwa, która gwarantuje, że żadne patogeny nie zostaną przeniesione z człowieka na człowieka podczas transfuzji krwi. Dlatego próbki krwi, które w wyniku standardowego badania przesiewowego w banku krwi zostały uznane za ujemne pod kątem patogenów innych niż P. vivax, powinny być wystarczająco bezpieczne, aby mogły zostać przeniesione z człowieka na człowieka przez ukąszenie komara. 2) Nie stwierdzono, aby komary Anopheles przenosiły jakikolwiek patogen inny niż Plasmodium. Przed badaniem przeprowadziliśmy szeroko zakrojone poszukiwania bibliograficzne i skonsultowaliśmy się z amerykańskimi i kolumbijskimi ekspertami w dziedzinie wirusologii, parazytologii i entomologii na temat potencjalnych patogenów, które mogą być przenoszone przez Anopheles i mogą stanowić zagrożenie dla ochotników narażonych na wyzwanie. Panował konsensus, że jak dotąd nie zgłoszono żadnego innego patogenu przenoszonego przez komary Anopheles, w tym te objęte badaniem przesiewowym banku krwi. Jednak komary były odrzucane przy użyciu procedury bezpieczeństwa biologicznego, jeśli po karmieniu krwi potwierdzono, że mają jakąkolwiek koinfekcję.

Zakażenie komarem

Komary Anopheles albimanus szczep Buenaventura są hodowane w warunkach laboratoryjnych w IDIV w Kalifornii od około 10 lat. Ta kolonia komarów była z powodzeniem wykorzystywana do regularnej produkcji sporozoitów14,16 oraz do badań nad odpornością blokującą przenoszenie malarii.17 Tutaj komary karmiono w ciągu 2-3 godzin po zebraniu krwi zakażonej P. vivax (gametocytemia ≥ 0,1%) w Buenaventura. 15 ml krwi odwirowano przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, usunięto osocze i komórki przemyto raz pożywką RPMI 1640 (Gibco Cell Culture Systems, Invitrogen, Grand Island, NY). Erytrocyty zarażone pasożytem rekonstytuowano do 50% hematokrytu za pomocą połączonej ludzkiej AB nieodpornej surowicy inaktywowanej dopełniaczem otrzymanej z banku krwi Czerwonego Krzyża i użyto do zakażenia partii 4000 samic komarów (w wieku 3-4 dni) przy użyciu membrany z płaszczem wodnym aparat w temperaturze 37°C, opisany wcześniej.14 Zainfekowane komary trzymano w ściśle określonych warunkach bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze 27 ± 1°C i wilgotności względnej 82% oraz dostarczano im roztwór cukru uzupełniony 0,05% kwasem para-aminobenzoesowym.18 Próbki karmionych komarów wycięto i zbadano mikroskopowo 7-8 dni po posiłku z krwią w celu określenia obecności oocyst w jelicie środkowym oraz w dniach 14 i 15 w celu oceny obecności sporozoitów w gruczołach ślinowych.19 Infekcje komarami oceniono jako 1+ (1-10 spz), 2+ (11-100 spz), 3+ (101-1000 spz) i 4+ (> 1001 spz).7

Sporozoitowe wyzwanie

Proponowana zakaźna dawka gryząca miała wynosić odpowiednio 3, 6 i 9 komarów. Dozwolony był jednak zakres plus lub minus jeden kęs na dawkę. Dlatego pudełka z siatką (7 × 7 × 7 cm) wypełniono 4, 7 i 10 komarami, aby mieć większą szansę na osiągnięcie docelowej dawki komara w jednej rundzie gryzienia. Uczestnicy, którzy nie osiągnęli minimalnej docelowej dawki, zostali poddani drugiej rundzie gryzienia. Osiemnastu ochotników, którzy nie chorowali na malarię, przydzielono losowo do jednej z trzech grup (N = 6) i narażono na nie według grup, od najmniejszej (3 ukąszenia) do największej (9 ukąszeń) liczby ukąszeń. Prowokacja sporozoitami została przeprowadzona przy ścisłym przestrzeganiu protokołu eksperymentalnego w bezpiecznym pomieszczeniu w jednostce entomologii w IDIV. Ochotników poproszono, aby nie używali żadnych środków chemicznych do stosowania miejscowego (np. mydła, dezodorantu, perfum), które mogłyby wpływać na karmienie komarów. Komary mogły gryźć stronę zginacza przedramienia przez okres od 10 do 15 minut, który wcześniej określono jako wystarczający do pełnego An. obrzęk albimanusa. Po ugryzieniu wszystkie komary wycięto w celu potwierdzenia obecności mączki z krwi i sporozoitów. Komary uznano za pozytywne, jeśli mikroskopowo wykryto dowolną liczbę sporozoitów (> 1). Uczestników badania obserwowano przez 1 godzinę w oddziale entomologii, a następnie telefonicznie 8 godzin później i ponownie badano 24 godziny później, aby ocenić odpowiedź na prowokację.

Diagnoza malarii i obserwacja pacjenta

Począwszy od dnia 7 po prowokacji, ochotnicy odbywali codzienne wizyty kontrolne, podczas których oceniano objawy malarii i pobierano krew do TBS i Plasmodium PCR (ten ostatni przeprowadzono retrospektywnie).

TBS wykonano przy użyciu 50 μl pełnej krwi pobranej przez nakłucie palca, którą rozprowadzono na prostokątnym obszarze o powierzchni około 1,5 cm2 i wybarwiono świeżo przygotowanym 10% barwnikiem Giemsy.20 Zanim szkiełko zostało uznane za negatywne, zbadano łącznie 300 pól mikroskopowych. Gdy TBS był dodatni, oznaczano ilościowo parazytemię przez oszacowanie liczby pasożytów zliczonych w obecności 300 leukocytów i obliczenie bezwzględnej parazytemii na podstawie liczby leukocytów na μl. Rozmazy odczytywali doświadczeni mikroskopiści, a losowa próbka TBS została poddana kontroli jakości przez mikroskopistę z programu zwalczania malarii.

Uczestnicy byli leczeni lekami przeciwmalarycznymi, gdy tylko pasożyty zostały wykryte przez TBS. Leczenie składało się z chlorochiny (1500 mg zasady chlorochiny podawanej doustnie w dawkach podzielonych: początkowo 600 mg, następnie 450 mg podane 24 i 48 godzin później) oraz prymachiny (dwie dawki 15 mg podawane raz dziennie przez 14 dni). W razie potrzeby ochotnicy otrzymywali płyny dożylne, środki przeciwbólowe i przeciwwymiotne. Oznaki i objawy wskazujące na malarię oceniano na podstawie badania klinicznego i oceniano je w skali od 1 do 5 zgodnie z ich ciężkością zgodnie z kryteriami CTCAE (National Cancer Institute) dotyczącymi zdarzeń niepożądanych (NCI) w następujący sposób: Stopień 1 = Niski, Stopień 2 = Umiarkowany, Stopień 3 = ciężki, stopień 4 = poważny i stopień 5 = śmierć. Świąd oceniano w skali od 1 do 3 (1 = łagodny lub zlokalizowany; 2 = intensywny lub rozległy; 3 = intensywny lub rozległy i zakłócający codzienne czynności). Ponieważ nie ma wspólnej terminologii AE, dla obrzęku i rumienia po ukąszeniach komarów, zastosowano adaptację z CTCAE v 3 dla „zmian w miejscu wstrzyknięcia/wynaczynienia” w następujący sposób: Stopień 1 = miejscowy ból/obrzęk i rumień; Stopień 2 = ból lub obrzęk ze stanem zapalnym lub zapaleniem żył; Stopień 3 = owrzodzenie lub martwica. Ból oceniano jako stopień 1 = łagodny, nie zakłócający funkcji; Stopień 2 = umiarkowany ból (ból lub środki przeciwbólowe zakłócające funkcjonowanie, ale nie zakłócające codziennych czynności); Stopień 3 = silny ból (ból lub środki przeciwbólowe poważnie utrudniające codzienne czynności).

Kliniczne testy laboratoryjne

Kliniczne laboratoryjne badanie przesiewowe z zamgleniem elektrokardiogramu potwierdziło stan zdrowia ochotników na 1 miesiąc przed prowokacją i po zakończeniu badania (tab. 1). Wszelkie nieprawidłowości stwierdzone w elektrokardiogramie uznano za kryterium wykluczenia. Testy na hemoglobinę, liczbę białych krwinek, liczbę płytek krwi i bilirubinę całkowitą przeprowadzono ponownie w dniach 11 i 53 po prowokacji.

metody statystyczne

Wielkość próby (N = 6 na grupę) została oparta na minimalnej liczbie osób, które mogłyby obserwować występowanie rzadszych zdarzeń (np. zdarzeń, które występują u około 5% osób) z rozsądnym prawdopodobieństwem opartym na założeniu dwumianu. Ogólna wielkość próby wynosząca 18 byłaby wystarczająca do wykrycia nawet rzadkich zdarzeń. Ustalono miareczkowanie ukąszeń komarów (dawek gryzących); zaczynając od arbitralnie uznanej minimalnej liczby wymaganej do wywołania infekcji. Okresy prepatentne i czas trwania objawów wyrażono jako średnie geometryczne. Różnice między grupami oszacowano testem Kruskala-Wallisa i uznano za statystycznie istotne przy wartościach P mniejszych niż 0,05.