인간 지원자의 Plasmodium Vivax에 대한 Sporozoite Challenge 모델의 재현성 평가

연구 설계

무작위, 공개 라벨 임상 시험은 말라리아를 경험하지 않은 지원자에서 P. vivax sporozoite 공격 모델, 특히 감염성 모기에 물린 횟수와 Giemsa로 염색한 두꺼운 혈액으로 감지할 수 있는 특허 기생충 발병 가능성 사이의 관계를 표준화하기 위해 설계되었습니다. 스미어(TBS). 연구는 두 단계로 나누어졌다. 단계 A는 인간에 대한 접종에 적합한 성숙한 P. vivax 포자소체를 생산하도록 설계되었으며; 단계 B는 스포로조이트 챌린지의 안전성과 재현성을 평가하도록 설계되었습니다. 단계 A를 위해, TBS에 의해 검출된 감염성 P. vivax gametocytes 환자는 콜롬비아 칼리와 부에나벤투라에 있는 면역학 연구소(IDIV)의 외래 환자 클리닉에서 모집되었습니다. 환자들은 자원봉사자들의 건강에 잠재적으로 위협이 될 수 있는 동시 감염에 대해 스크리닝된 35mL의 전혈을 기증했습니다. 그런 다음 혈액을 Anopheles 모기에게 인위적으로 공급했습니다.14 B 단계에서는 말라리아에 감염되지 않은 피험자를 3 ± 1, 6 ± 1 또는 9 ± 1 마리의 감염된 모기에 물려 감염의 전개년 기간과 그 재현성을 결정했습니다.

헌혈 및 혈액 품질 보증

EDTA vacutainer 튜브(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 사용하여 각 감염 환자로부터 35mL의 전혈을 수집하고, 이를 2개의 분취량으로 나누었습니다: 모기 먹이를 위한 15mL 샘플과 중합효소 연쇄 반응에 의한 Plasmodium 종( P. vivax, P. falciparum, P. malariae)의 확인을 포함하여 일반적인 감염원(바이러스, 박테리아, 기생충) 패널에 대한 일상적인 스크리닝을 위한 Valle del Lili 클리닉의 혈액 은행( PCR) (표 2).15 인간 지원자에 대한 혈액 검사 및 직접 모기 먹이주기의 근거는 다음 두 가지 전제에 근거합니다. 1) 표준 혈액 은행 검사는 수혈 중에 병원체가 사람 간에 전염되지 않도록 보장하는 안전 절차로 보편적으로 인정됩니다. 따라서 표준 혈액은행 스크리닝에서 P. vivax 이외의 병원체에 대해 음성으로 판정된 혈액 샘플은 모기 물림을 통해 사람에서 사람으로 옮길 수 있을 만큼 안전해야 합니다. 2) Anopheles 모기는 Plasmodium 이외의 병원체를 전파하는 것으로 보고된 적이 없습니다. 연구 전에 우리는 광범위한 서지 검색을 수행하고 바이러스학, 기생충학 및 곤충학에 대한 미국 및 콜롬비아 전문가와 Anopheles에 의해 전염될 수 있고 도전에 노출된 지원자에게 위협이 될 수 있는 잠재적 병원체에 대해 상의했습니다. 혈액 은행 검사에 포함된 것을 포함하여 Anopheles 모기에 의해 전염되는 것으로 보고된 다른 병원균은 아직 없다는 합의가 있었습니다. 그러나 혈액을 공급한 후 동시 감염이 확인된 경우 모기는 생물학적 안전 절차를 사용하여 폐기되었습니다.

모기 감염

Anopheles albimanus 모기 Buenaventura 계통은 칼리의 IDIV에서 약 10년 동안 실험실 조건에서 사육되었습니다. 이 모기 군락은 정기적으로 스포로조이트14,16를 생산하고 말라리아 전염 차단 면역에 대한 연구에 성공적으로 사용되었습니다.17 여기서 모기는 부에나벤투라에서 P. vivax에 감염된 혈액(gametocytemia ≥ 0.1%)을 채취한 후 2-3시간 이내에 먹이를 주었습니다. 15 mL 혈액을 실온에서 5분 동안 500 x g에서 원심분리하고, 혈장을 제거하고, 세포를 RPMI 1640 배지(Gibco Cell Culture Systems, Invitrogen, Grand Island, NY)로 1회 세척하였다. 기생 적혈구는 적십자 혈액 은행에서 얻은 풀링된 인간 AB 비면역 보체 불활성 혈청으로 50% 헤마토크릿으로 재구성되었고 워터 재킷 멤브레인을 사용하여 4,000마리의 암컷 모기(3-4일)를 감염시키는 데 사용되었습니다. 앞에서 설명한 37°C의 장치.14 감염된 모기는 27 ± 1°C, 상대 습도 82%의 엄격한 생물학적 안전 조건에서 유지되었으며 0.05% para-aminobenzoic-acid가 보충된 설탕 용액이 제공되었습니다.18 먹이를 먹은 모기의 샘플을 해부하고 혈액 식사 후 7~8일에 현미경으로 검사하여 중장에 난포낭의 존재를 확인하고 침샘에 포자소체의 존재를 평가하기 위해 14일과 15일에 검사했습니다.19 모기 감염은 1+(1-10 spz), 2+(11-100 spz), 3+(101-1000 spz) 및 4+(> 1001 spz)로 등급이 매겨졌습니다.7

포자소체 챌린지

제안된 감염 무는 용량은 각각 3, 6 및 9 모기였습니다. 단, 1회 분량의 플러스 마이너스 1바이트의 범위는 허용했다. 따라서 스크린 메쉬 상자(7 × 7 × 7cm)에 4, 7, 10마리의 모기를 채워 한 번에 목표 모기량을 달성할 수 있는 더 나은 기회를 얻었습니다. 최소 목표 복용량을 완료하지 못한 참가자는 두 번째 물림을 받았습니다. 말라리아에 감염되지 않은 18명의 지원자를 세 그룹(N = 6) 중 하나에 무작위로 할당하고 가장 적은 횟수(3번 물린 것)에서 가장 큰 물린 횟수(9번 물린 것)까지 그룹별로 노출시켰습니다. 스포로조이트 챌린지는 IDIV의 곤충학 유닛의 보안실에서 실험 프로토콜을 엄격히 준수하여 수행되었습니다. 자원 봉사자들은 모기 먹이기에 영향을 줄 수 있는 국소 화학 물질(예: 비누, 탈취제, 향수)을 사용하지 않도록 요청 받았습니다. 모기는 10~15분 동안 팔뚝의 굴근 쪽을 물도록 허용되었으며, 이는 이전에 전체 An에 충분하다고 결정되었습니다. 백색 충혈. 물린 후 모든 모기를 해부하여 혈분과 포자소체의 존재를 확인했습니다. 현미경으로 포자소체(> 1)가 검출되면 모기는 양성으로 간주됩니다. 연구 참가자들은 곤충학 유닛에서 1시간 동안 관찰되었고, 8시간 후에 전화를 받았고, 그 후 24시간 동안 다시 검사하여 공격에 대한 반응을 평가했습니다.

말라리아 진단 및 환자 추적

챌린지 후 7일 이후부터 지원자들은 말라리아의 증상 및 징후를 평가하고 TBS 및 Plasmodium PCR을 위해 혈액을 수집하는 동안 매일 후속 방문을 했습니다(후자는 후향적으로 수행됨).

TBS는 약 1.5 sq cm의 직사각형 영역에 걸쳐 손가락으로 채취한 50 μL의 전혈을 사용하여 수행되었으며 갓 준비한 10% Giemsa 염색으로 염색되었습니다.20 슬라이드가 음성으로 간주되기 전에 총 300개의 현미경 필드가 검사되었습니다. TBS가 양성으로 밝혀졌을 때, 300개의 백혈구가 존재할 때 계수된 기생충의 수를 추정하고 μL당 백혈구 수에 따라 절대 기생충혈증을 계산하여 기생충혈증을 정량화했습니다. 숙련된 현미경 검사자가 도말을 판독하고 무작위 TBS 샘플을 말라리아 제어 프로그램의 현미경 검사자가 품질 관리를 받았습니다.

참가자들은 TBS에 의해 기생충이 발견되자마자 항말라리아제를 투여받았다. 치료는 클로로퀸(클로로퀸 염기 ​​1,500mg을 분할 용량으로 경구 제공: 초기에 600mg, 24시간 및 48시간 후에 450mg 제공)과 프리마퀸(14일 동안 하루에 한 번 2회 15mg 용량 제공)으로 구성되었습니다. 자원봉사자들은 필요에 따라 정맥 주사액, 진통제 및 진토제를 제공받았습니다. 말라리아와 일치하는 징후 및 증상은 임상 시험에 의해 평가되었고 다음과 같이 국립 암 연구소(NCI)의 부작용 기준(CTCAE)에 따라 심각도에 따라 1-5등급으로 등급이 매겨졌습니다. 등급 1 = 낮음, 등급 2 = 보통, 등급 3 = 심각, 등급 4 = 심각, 등급 5 = 사망. 소양증은 1에서 3까지 등급이 매겨졌습니다(1 = 경미하거나 국소적임; 2 = 강하거나 광범위함; 3 = 강하거나 광범위하며 일상 생활 활동을 방해함). 일반적인 용어 AE 동의가 없기 때문에, 모기에 물린 후 부종 및 홍반에 대해 "주사 부위/유출 변화"에 대한 CTCAE v 3의 적응이 다음과 같이 사용되었습니다: 등급 1 = 국소 통증/부종 및 홍반; 등급 2 = 염증 또는 정맥염을 동반한 통증 또는 종기; 등급 3 = 궤양 또는 괴사. 통증은 등급 1 = 기능을 방해하지 않는 경증; 등급 2 = 중등도 통증(통증 또는 진통제가 기능을 방해하지만 일상 생활 활동을 방해하지는 않음); 등급 3 = 심한 통증(통증 또는 진통제가 일상 생활 활동을 심각하게 방해함).

임상 실험실 테스트

임상 실험실 스크리닝 in -clouding 심전도는 도전 1개월 전과 연구가 완료된 후 지원자의 건강 상태를 확인했습니다(표 1). 심전도에서 발견된 이상은 제외 기준으로 간주되었습니다. 헤모글로빈, 백혈구 수, 혈소판 수 및 총 빌리루빈에 대한 테스트를 챌린지 후 11일 및 53일에 다시 수행했습니다.

통계적 방법

표본 크기(그룹당 N = 6명)는 이항 가정을 기반으로 합당한 확률로 더 드문 사건(예: 개인의 약 5%에서 발생하는 사건)의 발생을 관찰할 수 있는 최소 개인 수를 기반으로 합니다. 18의 전체 샘플 크기는 드문 이벤트도 탐지하기에 충분합니다. 모기에 물린 적정량(물린 용량)을 설정했습니다. 감염을 일으키는 데 필요한 최소 수를 임의로 고려한 것으로 시작합니다. 전증 기간과 증상 지속 기간은 기하 평균으로 표현하였다. 그룹 간의 차이는 Kruskal-Wallis 테스트로 추정되었으며 P 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.