Evaluación de la reproducibilidad de un modelo de desafío de esporozoitos para Plasmodium Vivax en voluntarios humanos

Diseño del estudio

Se diseñó un ensayo clínico aleatorizado y abierto para estandarizar un modelo de desafío con esporozoítos de P. vivax en voluntarios sin experiencia previa en paludismo, específicamente, la relación entre el número de picaduras de mosquitos infecciosos y la probabilidad de desarrollar una parasitemia patente detectable mediante sangre espesa teñida con Giemsa. frotis (TBS). El estudio se dividió en dos pasos. El paso A se diseñó para producir esporozoitos maduros de P. vivax adecuados para la inoculación en seres humanos; y el Paso B fue diseñado para evaluar la seguridad y la reproducibilidad del desafío con esporozoitos. Para el Paso A, los pacientes con gametocitos de P. vivax infectivos detectados por TBS fueron reclutados de las consultas externas del Instituto de Inmunología (IDIV) en Cali y Buenaventura, Colombia. Los pacientes donaron 35 ml de sangre completa, que se analizó en busca de coinfecciones que pudieran representar una amenaza para la salud de los voluntarios. Luego, la sangre se alimentaba artificialmente a los mosquitos Anopheles.14 Para el Paso B, los sujetos que nunca habían padecido paludismo fueron expuestos a las picaduras de 3 ± 1, 6 ± 1 o 9 ± 1 mosquitos infectados para determinar el período prepatente de la infección y su reproducibilidad.

Donación de sangre y aseguramiento de la calidad de la sangre

Se utilizaron tubos vacutainer con EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) para recolectar 35 mL de sangre total de cada paciente infectado, que se dividieron en dos alícuotas: una muestra de 15 mL para alimentación de mosquitos y una muestra de 20 mL que se transportó a al banco de sangre de la Clínica Valle del Lili para el tamizaje de rutina de un panel de agentes infecciosos comunes (virales, bacterianos, parasitarios), incluyendo la confirmación de especies de Plasmodium (P. vivax, P. falciparum, P. malariae) por reacción en cadena de la polimerasa ( PCR) (tabla 2).15 La justificación detrás de la detección de sangre y la alimentación directa de mosquitos en voluntarios humanos se basó en dos premisas: 1) la detección estándar del banco de sangre se acepta universalmente como un procedimiento de seguridad que garantiza que no se transmitan patógenos de persona a persona durante una transfusión de sangre. Por lo tanto, las muestras de sangre que se determina que son negativas para otros patógenos que no sean P. vivax mediante un análisis estándar del banco de sangre deben ser lo suficientemente seguras como para transferirse de persona a persona a través de la picadura de un mosquito. 2) No se ha informado que los mosquitos Anopheles transmitan ningún otro patógeno que no sea Plasmodium. Antes del estudio, llevamos a cabo una extensa búsqueda bibliográfica y consultamos con expertos en virología, parasitología y entomología de EE. UU. y Colombia acerca de los patógenos potenciales que Anopheles podría transmitir y que podrían representar una amenaza para los voluntarios expuestos al desafío. Hubo consenso en que hasta el momento no se ha informado que los mosquitos Anopheles transmitan ningún otro patógeno, incluidos los incluidos en el análisis del banco de sangre. Sin embargo, los mosquitos se descartaron utilizando un procedimiento de bioseguridad si después de alimentarlos con sangre se confirmaba que tenían alguna coinfección.

infección por mosquitos

Los mosquitos Anopheles albimanus, cepa Buenaventura, se han criado en condiciones de laboratorio en el IDIV de Cali durante aproximadamente 10 años. Esta colonia de mosquitos se ha utilizado con éxito para producir regularmente esporozoítos14,16 y para estudios sobre la inmunidad que bloquea la transmisión de la malaria.17 Aquí, los mosquitos fueron alimentados dentro de las 2-3 horas posteriores a la recolección de sangre infectada con P. vivax (gametocitemia ≥ 0,1%) en Buenaventura. Los 15 ml de sangre se centrifugaron a 500 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente, se extrajo el plasma y las células se lavaron una vez con medio RPMI 1640 (Gibco Cell Culture Systems, Invitrogen, Grand Island, NY). Los eritrocitos parasitados se reconstituyeron al 50 % de hematocrito con suero inactivado del complemento no inmune AB humano combinado obtenido del banco de sangre de la Cruz Roja y se usaron para infectar lotes de 4000 mosquitos hembra (de 3 a 4 días de edad) usando una membrana recubierta de agua. aparato a 37°C, descrito previamente.14 Los mosquitos infectados se mantuvieron en estrictas condiciones de bioseguridad a 27 ± 1 °C y una humedad relativa del 82 % y se les suministró una solución de azúcar suplementada con ácido paraaminobenzoico al 0,05 %.18 Se diseccionaron muestras de mosquitos alimentados y se examinaron microscópicamente 7-8 días después de la ingestión de sangre para determinar la presencia de ooquistes en el intestino medio, y los días 14 y 15 para evaluar la presencia de esporozoítos en las glándulas salivales.19 Las infecciones por mosquitos se calificaron como 1+ (1-10 spz), 2+ (11-100 spz), 3+ (101-1000 spz) y 4+ (> 1001 spz).7

Desafío de esporozoitos

La dosis de picadura infecciosa propuesta sería de 3, 6 y 9 mosquitos, respectivamente. Sin embargo, se permitió un rango de más o menos un bocado por dosis. Por lo tanto, las cajas con malla de malla (7 × 7 × 7 cm) se llenaron con 4, 7 y 10 mosquitos, para tener una mejor oportunidad de lograr la dosis de mosquito objetivo en una sola ronda de picadura. Los participantes que no completaron la dosis mínima específica fueron sometidos a una segunda ronda de mordidas. Dieciocho voluntarios sin experiencia en malaria fueron asignados al azar a uno de tres grupos (N = 6) y fueron expuestos por grupo, desde el menor número de picaduras (3 picaduras) hasta el mayor (9 picaduras). La exposición a esporozoítos se llevó a cabo siguiendo estrictamente el protocolo experimental en una sala segura de la unidad de entomología del IDIV. Se pidió a los voluntarios que no usaran productos químicos tópicos (p. ej., jabón, desodorante, perfume) que pudieran afectar la alimentación de los mosquitos. Se permitió que los mosquitos picaran el lado flexor del antebrazo durante un período de 10 a 15 minutos, previamente determinado como suficiente para una An completa. Ingurgitación del albimano. Después de picar, todos los mosquitos fueron disecados para confirmar la presencia de harina de sangre y esporozoítos. Los mosquitos se consideraron positivos si se detectaba microscópicamente cualquier cantidad de esporozoítos (> 1). Los participantes del estudio fueron observados durante 1 hora en la unidad de entomología, seguidos por teléfono 8 horas más tarde y examinados nuevamente 24 horas después para evaluar la respuesta al desafío.

Diagnóstico de malaria y seguimiento de pacientes.

Desde el día 7 después del desafío en adelante, los voluntarios tuvieron visitas de seguimiento diarias durante las cuales se evaluaron los síntomas y signos de la malaria y se extrajo sangre para TBS y Plasmodium PCR (esta última realizada retrospectivamente).

Los TBS se realizaron utilizando 50 μL de sangre total recolectada por punción digital que se esparcieron sobre un área rectangular de aproximadamente 1,5 cm2 y se tiñeron con tinción de Giemsa al 10% recién preparada.20 Se examinaron un total de 300 campos microscópicos antes de que un portaobjetos se considerara negativo. Cuando se encontró TBS positivo, se cuantificó la parasitemia estimando el número de parásitos contados en presencia de 300 leucocitos y calculando la parasitemia absoluta según los recuentos de leucocitos por μL. Los frotis fueron leídos por microscopistas experimentados y un microscopista del programa de control de malaria sometió una muestra aleatoria de TBS a control de calidad.

Los participantes fueron tratados con medicamentos antipalúdicos tan pronto como TBS detectó parásitos. El tratamiento consistió en cloroquina (1500 mg de cloroquina base administrados por vía oral en dosis divididas: 600 mg inicialmente seguidos de 450 mg administrados 24 y 48 horas después) y primaquina (dos dosis de 15 mg administradas una vez al día durante 14 días). Los voluntarios recibieron fluidos intravenosos, analgésicos y antieméticos según fuera necesario. Los signos y síntomas compatibles con la malaria se evaluaron mediante un examen clínico y se calificaron del 1 al 5 según su gravedad siguiendo los criterios del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) para eventos adversos (CTCAE) de la siguiente manera: Grado 1 = Bajo, Grado 2 = Moderado, Grado 3 = Grave, Grado 4 = Grave y Grado 5 = Muerte. El prurito se graduó del 1 al 3 (1 = leve o localizado; 2 = intenso o generalizado; y 3 = intenso o generalizado e interfiriendo con las actividades de la vida diaria). Debido a que no existe un acuerdo común de EA en la terminología, para el edema y el eritema después de las picaduras de mosquitos, se utilizó una adaptación del CTCAE v 3 para "cambios en el lugar de la inyección/extravasación" de la siguiente manera: Grado 1 = dolor local/edema y eritema; Grado 2 = dolor o hinchazón con inflamación o flebitis; Grado 3 = ulceración o necrosis. El dolor se calificó como Grado 1 = leve que no interfiere con la función; Grado 2 = dolor moderado (dolor o analgésicos que interfieren con la función, pero que no interfieren con las actividades de la vida diaria); Grado 3 = dolor intenso (dolor o analgésicos que interfieren gravemente con las actividades de la vida diaria).

Pruebas de laboratorio clínico

El cribado de laboratorio clínico en el que se nubló un electrocardiograma confirmó el estado de salud de los voluntarios 1 mes antes de la exposición y después de que se completó el estudio (Tabla 1). Cualquier anomalía encontrada en el electrocardiograma se consideró como criterio de exclusión. Se realizaron de nuevo pruebas de hemoglobina, recuento de glóbulos blancos, recuento de plaquetas y bilirrubina total los días 11 y 53 después de la exposición.

métodos de estadística

El tamaño de la muestra (N = 6 por grupo) se basó en el número mínimo de personas a las que se les permitiría observar la ocurrencia de eventos más raros (p. ej., eventos que ocurren en aproximadamente el 5 % de las personas) con una probabilidad razonable basada en una suposición binomial. El tamaño total de la muestra de 18 sería suficiente para detectar incluso eventos raros. Se estableció una titulación de las picaduras de mosquitos (dosis de picadura); empezando por el que arbitrariamente se considera el número mínimo necesario para provocar una infección. Los períodos prepatentes y la duración de los síntomas se expresaron como medias geométricas. Las diferencias entre los grupos se estimaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis y se consideraron estadísticamente significativas a valores de P inferiores a 0,05.