ヒト 3 日目の胚のガラス化とゆっくりとした凍結

1. バックグラウンド

   ガラス化された卵割段階の胚の移植後に妊娠の成功を報告した研究がありますが、ほとんどの研究は卵母細胞と胚盤胞のガラス化に焦点を当てていました。 私たちが知る限り、無作為化された前向き研究の報告は 1 つしかありません。従来のゆっくりとした凍結法とガラス化 (40% エチレングリコールを含むナイロンループシステムを利用する) の両方が一般的な凍結方法であり、3 日目の胚について比較されました (Rama Raju、Haranath ら、2005 年）。 彼らは、ガラス化による着床および妊娠率 (それぞれ 14.9% および 35.0%) を報告しており、これは低速凍結プロトコルの率 (それぞれ 4.2% および 17.4%) よりも大幅に高い。 分割段階の胚の両方の凍結方法を比較する、より無作為化された研究がまだ必要です。

   LUFc (ヘミストロー) で使用されるガラス化法は、Rama Raju の無作為化試験で使用される方法よりも優れているという文献の証拠があります。 Liebermann と Tucker は、異常に受精した受精卵に由来する 3 日目の胚のガラス化について、ヘミストロー システムとクライオループ システムの両方を比較しました (Liebermann and Tucker, 2002)。 生存率に統計的な差は見られませんでしたが (p=0.07)、24 時間後の発育は、ヘミストローを使用した方が統計的に優れていました (p=0.002)。 この研究に基づいて、ラーマ ラージュの研究よりも良い結果が期待できます。

   ヘミストロー システムを使用した卵割段階の胚の凍結保存が発生および着床の可能性に及ぼす影響をさらに詳しく調べるために、ガラス化 (20% EG および 20% DMSO) の有効性を低速凍結と比較しました。

2. 材料および方法

   • 患者 この前向き研究では、間に IVF または ICSI を受けたすべての患者が含まれます。 新鮮胚移植は、授精後 3 日目に行った。 3日目に少なくとも6細胞期に達し、断片化が20％未満のすべての余剰胚は、ガラス化または低速凍結のいずれかを使用した凍結保存の対象と見なされました。
   • 無作為化 すべての胚は、2 つの方法のいずれかによって凍結保存されます。 無作為化は、授精後 3 日目に行われます。 実用上の理由から、同じ日に凍結されたすべての胚は、同じ凍結方法にランダムに割り当てられます。
   • レトロスペクティブ データ分析の結果 ガラス化は、2004 年 9 月以来、LUFc で標準的な凍結保存方法として使用されています。 そのため、3 日目の胚の凍結保存には徐冷とガラス化の両方が使用されていました。 使用される方法はワークロードに依存するため、無作為化は行われませんでした。 これらのデータのレトロスペクティブ分析 (低速グループで 43 サイクル、ガラス化グループで 81 サイクル) の後、ガラス化後の胚の生存率が大幅に増加することに気付きました (ガラス化グループで 81.2% 対 低速グループで 45.8%)。 ; p<0.0001)。 両方のグループ間で妊娠率に有意差はありませんでした（ガラス化で19.8％対遅いグループで30.2％; p = NS）。

   これまでのところ、解凍直後または解凍後 24 時間での生存率に顕著な違いが見られましたが、着床率の明確な違いはまだ発見されていないため、ランダム化試験を開始して、着床または妊娠レベルでの有意差を証明したいと考えています。

   • ヒト胚のガラス化 我々の方法は、Vanderzwalmen et al 2000 (Vanderzwalmen, Bertin et al., 2000) によって記述された手順に基づいていました。 最初に胚を室温で２分間平衡化した（１７％ＨＳＡを含むＰＢＳ）。 次に、それらを最初のガラス化溶液 (PBS + 14% HSA + 10% DMSO + 10% エチレングリコール) に室温で 2 分間移し、続いて 2 番目のガラス化溶液 (PBS + 12% HSA + 20% DMSO + 20% エチレングリコール + フィコール + スクロース)。 最後に、胚を約 3 μl の液滴でヘミストローにできるだけ早くロードし、液体窒素に直接浸しました。 その後、ヘミストローが CBS ストローに挿入されました。
   • ガラス化後の解凍 正確に 1 つの胚を保持している半ストローを CBS ストローから引き抜き、すぐに 3 ml の最初の解凍液 (20% HSA を含む PBS) に 36°C で 3 分間浸しました。 その後、胚を他の 3 つの解凍溶液 (それぞれ 0.5M スクロース、0.25M スクロース、および 0.125M スクロース) に 2 分間連続的にさらしました。 胚を完全に洗浄し、COOK胚盤胞培地で一晩インキュベートしました。 割球の少なくとも 50% がガラス化手順を生き残った場合、胚は「生き残った」と見なされます。
   • 低速凍結および解凍手順 低速凍結および解凍手順では、凍結保護剤としてプロパンジオールおよびスクロースを含むCookのHEPES緩衝市販凍結培地(K-SICS 5000)を使用した。
3. 統計分析と検出力計算

文献 (Rama Raju et al. 2005) に基づいて、ガラス固化グループ (25%) と徐冷グループ (15%) の着床率が 10% 高いと予想されます (Rama Raju, Haranath et al., 2005)。 α=0.05 および検出力 (β) 0.80 で着床または妊娠レベルでの有意差を証明するため。 したがって、各グループに 270 個の胚を移植する必要があります。