Vitrifikation versus langsames Einfrieren menschlicher Tag-3-Embryonen

1. Hintergrund

   Obwohl es Studien gibt, die über erfolgreiche Schwangerschaften nach dem Transfer von verglasten Embryonen im Teilungsstadium berichteten, konzentrierten sich die meisten Studien auf die Verglasung von Oozyten und Blastozysten. Soweit wir wissen, gibt es nur einen Bericht einer randomisierten prospektiven Studie, in der beide gängigen Einfriermethoden – herkömmliches langsames Einfrieren und Vitrifikation (unter Verwendung des Nylonschlaufensystems mit 40 % Ethylenglykol) – für Tag-3-Embryonen verglichen wurden (Rama Raju, Haranath et al., 2005). Sie berichten von einer Implantations- und Schwangerschaftsrate (14,9 % bzw. 35,0 %) mit Vitrifikation, die signifikant höher ist als die Raten mit dem Slow-Freezing-Protokoll (4,2 % bzw. 17,4 %). Es besteht noch Bedarf an weiteren randomisierten Studien, die beide Einfriermethoden für Embryonen im Teilungsstadium vergleichen.

   In der Literatur gibt es Hinweise darauf, dass die bei LUFc (Hemi-Stroh) verwendete Vitrifizierungsmethode der in der randomisierten Studie von Rama Raju verwendeten Methode überlegen ist. Liebermann und Tucker verglichen sowohl das Hemi-Stroh- als auch das Cryoloop-System für die Vitrifikation von Tag-3-Embryonen, die aus abnormal befruchteten Zygoten stammen (Liebermann und Tucker, 2002). Sie fanden keinen statistischen Unterschied (p = 0,07) in der Überlebensrate, aber die Entwicklung nach 24 Stunden war statistisch besser (p = 0,002) unter Verwendung von Halbstrohhalmen. Basierend auf dieser Studie würden wir sogar bessere Ergebnisse als die Studie von Rama Raju erwarten.

   Um die Wirkung der Kryokonservierung von Embryonen im Teilungsstadium unter Verwendung des Halbstrohsystems auf das Entwicklungs- und Implantationspotential weiter zu verfeinern, wurde die Wirksamkeit der Vitrifikation (20 % EG und 20 % DMSO) mit langsamem Einfrieren verglichen.

2. Materialen und Methoden

   • Patienten In diese prospektive Studie sind alle Patienten eingeschlossen, die zwischenzeitlich IVF oder ICSI unterzogen wurden. Am 3. Tag nach der Besamung wurde ein frischer Embryotransfer durchgeführt. Alle überschüssigen Embryonen, die am Tag 3 mindestens das 6-Zell-Stadium erreichten und weniger als 20 % Fragmentierung aufwiesen, wurden für die Kryokonservierung entweder durch Vitrifikation oder durch langsames Einfrieren in Betracht gezogen.
   • Randomisierung Alle Embryonen werden mit einer der beiden Methoden kryokonserviert. Die Randomisierung findet am 3. Tag nach der Besamung statt. Aus praktischen Gründen werden alle am selben Tag eingefrorenen Embryonen nach dem Zufallsprinzip der gleichen Einfriermethode zugeordnet.
   • Ergebnisse aus retrospektiver Datenanalyse Seit September 2004 wird am LUFc die Vitrifikation als Standardverfahren zur Kryokonservierung eingesetzt. Daher wurden sowohl langsames Einfrieren als auch Vitrifikation für die Kryokonservierung von Tag-3-Embryonen verwendet. Die verwendete Methode hängt von der Arbeitsbelastung ab… es gab also keine Randomisierung. Nach einer retrospektiven Analyse dieser Daten (124 Zyklen 43 in der langsamen Gruppe und 81 in der Vitrifikationsgruppe) stellten wir eine signifikante Steigerung der Überlebensrate der Embryonen nach der Vitrifikation fest (81,2 % in der Vitrifikationsgruppe gegenüber 45,8 % in der langsamen Gruppe). ; p<0,0001). Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Schwangerschaftsrate zwischen beiden Gruppen (19,8 % in der Vitrifikation versus 30,2 % in der langsamen Gruppe; p = NS).

   Bisher haben wir einen bemerkenswerten Unterschied im Überleben unmittelbar oder 24 Stunden nach dem Auftauen gesehen, aber ein deutlicher Unterschied in der Implantationsrate wurde noch nicht entdeckt, daher möchten wir eine randomisierte Studie starten, um einen signifikanten Unterschied auf Implantations- oder Schwangerschaftsebene nachzuweisen.

   • Vitrifikation menschlicher Embryonen Unser Verfahren basierte auf dem von Vanderzwalmen et al. 2000 beschriebenen Verfahren (Vanderzwalmen, Bertin et al., 2000). Zunächst wurden die Embryonen 2 min bei Raumtemperatur äquilibriert (PBS mit 17 % HSA). Sie wurden dann für 2 min bei RT in die erste Vitrifikationslösung (PBS + 14 % HSA + 10 % DMSO + 10 % Ethylenglycol) überführt, gefolgt von 30 Sekunden in der zweiten Vitrifikationslösung (PBS + 12 % HSA + 20 % DMSO + 20 % Ethylenglykol + Ficoll + Saccharose). Schließlich wurden die Embryonen so schnell wie möglich in einem Tröpfchen von ungefähr 3 &mgr;l auf das Hemi-Stroh geladen und direkt in flüssigen Stickstoff getaucht. Anschließend wurde das Halbstroh in das CBS-Stroh eingelegt.
   • Auftauen nach der Vitrifikation Der Halbstrohhalm mit genau einem Embryo wurde aus dem CBS-Strohhalm gezogen und sofort in 3 ml der ersten Auftaulösung (PBS mit 20 % HSA) für 3 min bei 36°C getaucht. Danach wurde der Embryo nacheinander für 2 min den 3 anderen Auftaulösungen (0,5 M Saccharose, 0,25 M Saccharose bzw. 0,125 M Saccharose) ausgesetzt. Die Embryonen wurden gründlich gewaschen und über Nacht in COOK-Blastozystenmedium inkubiert. Embryonen gelten als „überlebt“, wenn mindestens 50 % der Blastomeren den Vitrifizierungsprozess überlebt haben.
   • Langsames Einfrier- und Auftauverfahren Für das langsame Einfrier- und Auftauverfahren verwendeten wir das HEPES-gepufferte kommerzielle Einfriermedium von Cook (K-SICS 5000) mit Propandiol und Saccharose als Kryoschutzmittel.
3. Statistische Analyse und Leistungsberechnung

Basierend auf der Literatur (Rama Raju et al. 2005) erwarten wir eine 10 % höhere Implantationsrate in der Vitrifikationsgruppe (25 %) gegenüber der Slow-Freezing-Gruppe (15 %) (Rama Raju, Haranath et al., 2005). Nachweis eines signifikanten Unterschieds auf Implantations- oder Schwangerschaftsebene mit α=0,05 und einer Power (β) von 0,80. Daher bräuchten wir 270 Embryonen, die in jeder Gruppe transferiert werden.