Zeszklenie a powolne zamrażanie ludzkich embrionów dnia 3

1. Tło

   Chociaż istnieją badania, w których opisano udane ciąże po przeniesieniu zeszklonych zarodków w stadium rozszczepiania, większość badań koncentrowała się na witryfikacji oocytów i blastocyst. O ile nam wiadomo, istnieje tylko jedno doniesienie z randomizowanego badania prospektywnego, w którym obie powszechnie stosowane metody zamrażania — konwencjonalne powolne zamrażanie i witryfikacja (z wykorzystaniem systemu nylonowej pętli z 40% glikolem etylenowym) zostały porównane dla zarodków w 3 dniu (Rama Raju, Haranath i in., 2005). Zgłaszają odsetek zagnieżdżeń i ciąż (odpowiednio 14,9% i 35,0%) z witryfikacją, który jest znacznie wyższy niż wskaźniki z protokołem powolnego zamrażania (odpowiednio 4,2% i 17,4%). Nadal istnieje potrzeba większej liczby randomizowanych badań porównujących obie metody zamrażania zarodków w stadium rozszczepienia.

   Istnieją dowody w literaturze, że metoda witryfikacji stosowana w LUFc (hemi-słoma) jest lepsza od metody stosowanej w randomizowanym badaniu Rama Raju. Liebermann i Tucker porównali zarówno system hemistraw, jak i krioloop do witryfikacji zarodków trzeciego dnia pochodzących z nieprawidłowo zapłodnionych zygot (Liebermann i Tucker, 2002). Nie stwierdzili statystycznej różnicy (p=0,07) we wskaźniku przeżywalności, ale rozwój po 24 godzinach był statystycznie lepszy (p=0,002) przy użyciu półsłomek. Opierając się na tym badaniu, spodziewalibyśmy się nawet lepszych wyników niż badanie Rama Raju.

   Aby jeszcze bardziej udoskonalić wpływ kriokonserwacji zarodków w fazie rozszczepiania przy użyciu systemu hemi-straw na potencjał rozwojowy i implantacyjny, porównano skuteczność witryfikacji (20% EG i 20% DMSO) z powolnym zamrażaniem.

2. Materiały i metody

   • Pacjenci W tym prospektywnym badaniu uwzględniono wszystkich pacjentów poddanych IVF lub ICSI pomiędzy. Transfer świeżych zarodków przeprowadzono w 3 dniu po inseminacji. Wszystkie nadwyżkowe zarodki, które osiągnęły co najmniej stadium 6 komórek w dniu 3 i miały mniej niż 20% fragmentacji, były brane pod uwagę do kriokonserwacji przy użyciu witryfikacji lub powolnego zamrażania.
   • Randomizacja Wszystkie zarodki będą kriokonserwowane jedną z dwóch metod. Randomizacja odbędzie się 3 dnia po inseminacji. Ze względów praktycznych wszystkie zarodki zamrożone tego samego dnia zostaną losowo przydzielone do tej samej metody zamrażania.
   • Wyniki retrospektywnej analizy danych Witryfikację stosuje się jako standardową metodę kriokonserwacji w LUFc od września 2004 r. Tak więc zarówno powolne zamrażanie, jak i witryfikacja zostały użyte do kriokonserwacji zarodków trzeciego dnia. Zastosowana metoda zależy od obciążenia pracą… więc nie było randomizacji. Po retrospektywnej analizie tych danych (124 cykle 43 w grupie wolnej i 81 w grupie witryfikacji) zauważyliśmy znaczny wzrost przeżywalności zarodków po witryfikacji (81,2% w grupie witryfikacji w porównaniu z 45,8% w grupie wolnej ;p<0,0001). Nie było istotnej różnicy w częstości ciąż pomiędzy obiema grupami (19,8% w grupie zeszklenia w porównaniu z 30,2% w grupie powolnej; p=NS).

   Jak dotąd zauważyliśmy niezwykłą różnicę w przeżywalności natychmiast lub 24 godziny po rozmrożeniu, ale wyraźna różnica w szybkości implantacji nie została jeszcze odkryta, dlatego chcielibyśmy rozpocząć randomizowane badanie, aby udowodnić znaczącą różnicę na poziomie implantacji lub ciąży.

   • Witryfikacja embrionów ludzkich Nasza metoda opierała się na procedurze opisanej przez Vanderzwalmen i in. 2000 (Vanderzwalmen, Bertin i in., 2000). Najpierw zarodki równoważono (PBS z 17% HSA) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Następnie przeniesiono je do pierwszego roztworu do witryfikacji (PBS + 14% HSA + 10% DMSO + 10% glikolu etylenowego) na 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie przez 30 sekund w drugim roztworze do witryfikacji (PBS + 12% HSA + 20% DMSO + glikol etylenowy 20% + fikol + sacharoza). Na koniec zarodki załadowano tak szybko, jak to możliwe na słomkę Hemi w kropli o objętości około 3 µl i zanurzono bezpośrednio w ciekłym azocie. Następnie półsłomkę umieszczono w słomce CBS.
   • Rozmrażanie po zeszkleniu Półsłomkę zawierającą dokładnie jeden zarodek wyciągnięto ze słomki CBS i natychmiast zanurzono w 3 ml pierwszego roztworu do rozmrażania (PBS z 20% HSA) na 3 minuty w temperaturze 36°C. Następnie zarodek był kolejno eksponowany przez 2 minuty na 3 inne roztwory do rozmrażania (odpowiednio 0,5 M sacharoza, 0,25 M sacharoza i 0,125 M sacharoza). Zarodki dokładnie przemyto i inkubowano przez noc w pożywce COOK do blastocysty. Zarodki uważa się za „przeżywające”, jeśli co najmniej 50% blastomerów przeżyło procedurę witryfikacji.
   • Procedura powolnego zamrażania i rozmrażania Do procedury powolnego zamrażania i rozmrażania użyliśmy komercyjnego podłoża do zamrażania buforowanego HEPES firmy Cook (K-SICS 5000) z propandiolem i sacharozą jako środkami krioochronnymi.
3. Analiza statystyczna i obliczanie mocy

Na podstawie literatury (Rama Raju i in. 2005) spodziewamy się o 10% wyższego wskaźnika implantacji w grupie witryfikacji (25%) w porównaniu z grupą powolnego zamrażania (15%) (Rama Raju, Haranath i in., 2005). Aby udowodnić istotną różnicę na poziomie implantacji lub ciąży z α=0,05 i mocą (β) 0,80. Dlatego potrzebowalibyśmy 270 transferowanych zarodków w każdej grupie.