Vitrificazione contro congelamento lento di embrioni umani giorno 3

1. Sfondo

   Sebbene ci siano studi che hanno riportato gravidanze riuscite dopo il trasferimento di embrioni vetrificati in fase di scissione, la maggior parte degli studi si è concentrata sulla vetrificazione di ovociti e blastocisti. Per quanto ne sappiamo, esiste un solo rapporto di uno studio prospettico randomizzato in cui entrambi i metodi di congelamento comuni - congelamento lento convenzionale e vitrificazione (utilizzando il sistema ad anello di nylon con il 40% di glicole etilenico) sono stati confrontati per gli embrioni del giorno 3 (Rama Raju, Haranath et al., 2005). Riferiscono un tasso di impianto e di gravidanza (rispettivamente 14,9% e 35,0%) con la vitrificazione, che è significativamente superiore ai tassi con il protocollo di congelamento lento (rispettivamente 4,2% e 17,4%). C'è ancora bisogno di più studi randomizzati che mettano a confronto entrambi i metodi di congelamento per gli embrioni in fase di scissione.

   Esistono prove in letteratura che il metodo di vetrificazione utilizzato presso LUFc (semi-paglia) è superiore al metodo utilizzato nello studio randomizzato di Rama Raju. Liebermann e Tucker hanno confrontato sia il sistema emi-paglia che il sistema cryoloop per la vetrificazione degli embrioni del giorno 3 derivati ​​da zigoti fecondati in modo anomalo (Liebermann e Tucker, 2002). Non hanno trovato alcuna differenza statistica (p=0,07) nel tasso di sopravvivenza, ma lo sviluppo dopo 24 ore era statisticamente migliore (p=0,002) utilizzando le emi-paillette. Sulla base di questo studio ci aspetteremmo persino risultati migliori rispetto allo studio di Rama Raju.

   Per perfezionare ulteriormente l'effetto della crioconservazione degli embrioni in fase di scissione utilizzando il sistema emi-paglia sul potenziale di sviluppo e impianto, l'efficacia della vetrificazione (20% EG e 20% DMSO) è stata confrontata con il congelamento lento.

2. Materiali e metodi

   • Pazienti In questo studio prospettico sono inclusi tutti i pazienti sottoposti a fecondazione in vitro o ICSI. Il trasferimento di embrioni freschi è stato effettuato il giorno 3 dopo l'inseminazione. Tutti gli embrioni in eccesso che hanno raggiunto almeno lo stadio di 6 cellule il giorno 3 e avevano una frammentazione inferiore al 20% sono stati considerati per la crioconservazione utilizzando la vetrificazione o il congelamento lento.
   • Randomizzazione Tutti gli embrioni saranno criopreservati con uno dei due metodi. La randomizzazione avverrà il giorno 3 dopo l'inseminazione. Per motivi pratici, tutti gli embrioni congelati nello stesso giorno saranno assegnati in modo casuale allo stesso metodo di congelamento.
   • Risultati dell'analisi retrospettiva dei dati La vitrificazione è stata utilizzata come metodo standard di crioconservazione al LUFc dal settembre 2004. Quindi sia il congelamento lento che la vitrificazione sono stati utilizzati per la crioconservazione degli embrioni del terzo giorno. Il metodo utilizzato dipende dal carico di lavoro... quindi non c'era randomizzazione. Dopo un'analisi retrospettiva di questi dati (124 cicli 43 nel gruppo lento e 81 nel gruppo vitrificazione), abbiamo notato un aumento significativo della sopravvivenza degli embrioni dopo la vitrificazione (81,2% nel gruppo vitrificazione contro 45,8% nel gruppo lento ; p<0,0001). Non c'era alcuna differenza significativa nel tasso di gravidanza tra i due gruppi (19,8% nella vitrificazione rispetto al 30,2% nel gruppo lento; p=NS).

   Finora abbiamo visto una notevole differenza nella sopravvivenza immediatamente o 24 ore dopo lo scongelamento, ma non è stata ancora scoperta una chiara differenza nel tasso di impianto, quindi vorremmo iniziare uno studio randomizzato per dimostrare una differenza significativa a livello di impianto o gravidanza.

   • Vitrificazione di embrioni umani Il nostro metodo era basato sulla procedura descritta da Vanderzwalmen et al 2000 (Vanderzwalmen, Bertin et al., 2000). Per prima cosa gli embrioni sono stati equilibrati (PBS con 17% HSA) per 2 minuti a temperatura ambiente. Sono stati quindi trasferiti nella prima soluzione di vetrificazione (PBS + 14% HSA + 10% DMSO + 10% glicole etilenico) per 2 minuti a temperatura ambiente seguiti da 30 secondi nella seconda soluzione di vetrificazione (PBS + 12% HSA + 20% DMSO + 20% glicole etilenico + ficoll + saccarosio). Infine gli embrioni sono stati caricati il ​​più velocemente possibile sulla Hemi-paglia in una goccia di circa 3 µl e immersi direttamente in azoto liquido. Successivamente la semipaglia è stata inserita nella cannuccia CBS.
   • Scongelamento dopo vetrificazione La semipaglia contenente esattamente un embrione è stata estratta dalla cannuccia CBS e immediatamente immersa in 3 ml della prima soluzione di scongelamento (PBS con 20% HSA) per 3 minuti a 36°C. Successivamente l'embrione è stato esposto consecutivamente per 2 minuti alle altre 3 soluzioni di scongelamento (rispettivamente 0,5 M di saccarosio, 0,25 M di saccarosio e 0,125 M di saccarosio). Gli embrioni sono stati lavati accuratamente e incubati durante la notte nel mezzo di blastocisti COOK. Gli embrioni sono considerati "sopravvissuti" se almeno il 50% dei blastomeri è sopravvissuto alla procedura di vetrificazione.
   • Procedura di congelamento e scongelamento lento Per la procedura di congelamento e scongelamento lento abbiamo utilizzato il mezzo di congelamento commerciale tampone HEPES di Cook (K-SICS 5000) con propandiolo e saccarosio come crioprotettori.
3. Analisi statistica e calcolo della potenza

Sulla base della letteratura (Rama Raju et al 2005) ci aspettiamo un tasso di impianto superiore del 10% nel gruppo di vitrificazione (25%) rispetto al gruppo di congelamento lento (15%) (Rama Raju, Haranath et al., 2005). Dimostrare una differenza significativa a livello di impianto o di gravidanza con α=0,05 e una potenza (β) di 0,80. Quindi avremmo bisogno di 270 embrioni trasferiti in ogni gruppo.