Forglasning versus langsom nedfrysning af menneskelige embryoner på dag 3

1. Baggrund

   Selvom der er undersøgelser, der rapporterede succesfulde graviditeter efter overførsel af forglasset spaltningsstadie-embryoner, fokuserede de fleste af undersøgelserne på forglasning af oocytter og blastocyster. Så vidt vi ved, er der kun én rapport fra et randomiseret prospektivt studie, hvor begge almindelige frysemetoder - konventionel langsom nedfrysning og forglasning (ved brug af nylonsløjfesystemet med 40% ethylenglycol), blev sammenlignet for dag 3 embryoner (Rama) Raju, Haranath et al., 2005). De rapporterer en implantations- og graviditetsrate (henholdsvis 14,9 % og 35,0 %) med forglasning, hvilket er signifikant højere end hastighederne med protokollen for langsom frysning (henholdsvis 4,2 % og 17,4 %). Der er stadig behov for flere randomiserede undersøgelser, som sammenligner begge nedfrysningsmetoder for embryoner i spaltningsstadiet.

   Der er dokumentation i litteraturen for, at den forglasningsmetode, der anvendes ved LUFc (hemi-halm), er overlegen i forhold til den metode, der blev brugt i det randomiserede forsøg med Rama Raju. Liebermann og Tucker sammenlignede både hemi-halm- og kryoloopsystemet til forglasning af dag 3-embryoner afledt af unormalt befrugtede zygoter (Liebermann og Tucker, 2002). De fandt ingen statistisk forskel (p=0,07) i overlevelsesraten, men udviklingen efter 24 timer var statistisk bedre (p =0,002) ved brug af halvstrå. Baseret på denne undersøgelse ville vi endda forvente bedre resultater end undersøgelsen af ​​Rama Raju.

   For yderligere at forfine effekten af ​​kryokonservering af embryoner i spaltningsstadiet ved hjælp af hemi-halmsystemet på udviklings- og implantationspotentiale, blev effektiviteten af ​​forglasning (20 % EG og 20 % DMSO) sammenlignet med langsom frysning.

2. Materialer og metoder

   • Patienter I denne prospektive undersøgelse er alle patienter, der har gennemgået IVF eller ICSI, inkluderet. Frisk embryooverførsel blev udført på dag 3 efter insemination. Alle overskydende embryoner, som nåede mindst 6-cellestadiet på dag 3 og havde mindre end 20 % fragmentering, blev overvejet til kryokonservering ved hjælp af enten forglasning eller langsom frysning.
   • Randomisering Alle embryoner vil blive kryokonserveret ved en af ​​de to metoder. Randomisering vil finde sted på dag 3 efter insemination. Af praktiske årsager vil alle embryoner, der fryses på samme dag, blive tilfældigt tildelt den samme nedfrysningsmetode.
   • Resultater fra retrospektiv dataanalyse. Forglasning er blevet brugt som standard kryokonserveringsmetode på LUFc siden september 2004. Så både langsom frysning og forglasning var blevet brugt til kryokonservering af dag 3-embryoner. Den anvendte metode afhænger af arbejdsbyrden... så der var ingen randomisering. Efter en retrospektiv analyse af disse data (124 cyklusser 43 i den langsomme gruppe og 81 i forglasningsgruppen) bemærkede vi en signifikant stigning i overlevelsen af ​​embryonerne efter forglasning (81,2% i forglasningsgruppen versus 45,8% i den langsomme gruppe p<0,0001). Der var ingen signifikant forskel i graviditetsraten mellem begge grupper (19,8 % i forglasningen versus 30,2 % i langsom gruppe; p=NS).

   Indtil videre har vi set en bemærkelsesværdig forskel i overlevelse umiddelbart eller 24 timer efter optøning, men en klar forskel i implantationshastigheden er endnu ikke opdaget, derfor vil vi gerne starte et randomiseret forsøg for at bevise en signifikant forskel på implantations- eller graviditetsniveau.

   • Forglasning af menneskelige embryoner Vores metode var baseret på proceduren beskrevet af Vanderzwalmen et al. 2000 (Vanderzwalmen, Bertin et al., 2000). Først blev embryoerne ækvilibreret (PBS med 17% HSA) i 2 minutter ved stuetemperatur. De blev derefter overført til den første forglasningsopløsning (PBS + 14% HSA + 10% DMSO + 10% ethylenglycol) i 2 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af 30 sekunder i den anden forglasningsopløsning (PBS + 12% HSA + 20% DMSO + 20 % ethylenglycol + ficoll + saccharose). Til sidst blev embryonerne sat så hurtigt som muligt på Hemi-halmen i en dråbe på ca. 3 µl og nedsænket direkte i flydende nitrogen. Bagefter blev halv-halmen indsat i CBS-halmen.
   • Optøning efter forglasning. Halmhalmen med præcis ét embryo blev trukket ud af CBS-halmen og straks nedsænket i 3 ml af den første optøningsopløsning (PBS med 20% HSA) i 3 minutter ved 36°C. Bagefter blev embryonet eksponeret fortløbende i 2 minutter for de 3 andre optøningsopløsninger (henholdsvis 0,5 M saccharose, 0,25 M saccharose og 0,125 M saccharose). Embryonerne blev vasket grundigt og inkuberet natten over i COOK blastocyst medium. Embryoer betragtes som 'overlevede', hvis mindst 50 % af blastomererne overlevede forglasningsproceduren.
   • Langsom nedfrysnings- og optøningsprocedure Til den langsomme nedfrysnings- og optøningsprocedure brugte vi det HEPES-buffede kommercielle frysemedium fra Cook (K-SICS 5000) med propandiol og saccharose som kryobeskyttelsesmidler.
3. Statistisk analyse og effektberegning

Baseret på litteratur (Rama Raju et al. 2005) forventer vi en 10 % højere implantationshastighed i forglasningsgruppen (25 %) i forhold til gruppen med langsom frysning (15 %) (Rama Raju, Haranath et al., 2005). For at bevise en signifikant forskel på implantations- eller graviditetsniveauet med α=0,05 og en styrke (β) på 0,80. Derfor ville vi have brug for 270 embryoner overført i hver gruppe.