Vitrifikace versus pomalé zmrazování lidských embryí 3. dne

1. Pozadí

   I když existují studie, které uvádějí úspěšná těhotenství po přenosu embryí ve vitrifikovaném stádiu štěpení, většina studií se zaměřila na vitrifikaci oocytů a blastocyst. Pokud víme, existuje pouze jedna zpráva o randomizované prospektivní studii, kde byly obě běžné metody zmrazování – konvenční pomalé zmrazování a vitrifikace (využívající systém nylonové smyčky se 40 % ethylenglykolu), porovnávány pro embrya 3. dne (Rama Raju, Haranath a kol., 2005). Uvádějí míru implantace a otěhotnění (14,9 % a 35,0 %) s vitrifikací, což je významně vyšší počet než u protokolu pomalého zmrazení (4,2 % a 17,4 %). Stále je zapotřebí více randomizovaných studií, které srovnávají obě metody zmrazení pro embrya ve fázi štěpení.

   V literatuře existují důkazy, že metoda vitrifikace použitá na LUFc (hemi-straw) je lepší než metoda použitá v randomizované studii Rama Raju. Liebermann a Tucker porovnávali systém hemislámy a kryoloop pro vitrifikaci embryí 3. dne pocházejících z abnormálně oplodněných zygot (Liebermann a Tucker, 2002). Nezjistili žádný statistický rozdíl (p=0,07) v míře přežití, ale vývoj po 24 hodinách byl statisticky lepší (p=0,002) s použitím polobrček. Na základě této studie bychom dokonce očekávali lepší výsledky než studie Ramy Raju.

   Pro další zpřesnění vlivu kryokonzervace embryí ve stádiu štěpení pomocí systému hemi-slam na vývojový a implantační potenciál byla účinnost vitrifikace (20 % EG a 20 % DMSO) porovnána s pomalým zmrazením.

2. Materiály a metody

   • Pacienti V této prospektivní studii jsou zahrnuti všichni pacienti, kteří mezitím podstoupili IVF nebo ICSI. Transfer čerstvého embrya byl proveden 3. den po inseminaci. Všechna nadbytečná embrya, která dosáhla alespoň 6-buněčného stadia 3. den a měla méně než 20% fragmentaci, byla zvažována pro kryokonzervaci za použití buď vitrifikace nebo pomalého zmrazení.
   • Randomizace Všechna embrya budou kryokonzervována jednou ze dvou metod. Randomizace proběhne 3. den po inseminaci. Z praktických důvodů budou všechna embrya zmrazená ve stejný den náhodně přiřazena ke stejné metodě zmrazení.
   • Výsledky retrospektivní analýzy dat Vitrifikace se na LUFc používá jako standardní metoda kryokonzervace od září 2004. Takže pro kryokonzervaci embryí 3. dne bylo použito pomalé zmrazování i vitrifikace. Použitá metoda závisí na pracovní zátěži… takže nedošlo k žádné randomizaci. Po retrospektivní analýze těchto dat (124 cyklů 43 ve skupině pomalé a 81 ve skupině s vitrifikací) jsme zaznamenali významný nárůst přežití embryí po vitrifikaci (81,2 % ve skupině s vitrifikací oproti 45,8 % ve skupině pomalé p<0,0001). Mezi oběma skupinami nebyl signifikantní rozdíl v četnosti těhotenství (19,8 % ve vitrifikaci versus 30,2 % ve skupině s pomalým tempem; p=NS).

   Dosud jsme viděli pozoruhodný rozdíl v přežití okamžitě nebo 24 hodin po rozmrazení, ale jasný rozdíl v rychlosti implantace nebyl dosud objeven, proto bychom rádi zahájili randomizovanou studii, abychom prokázali významný rozdíl na úrovni implantace nebo těhotenství.

   • Vitrifikace lidských embryí Naše metoda byla založena na postupu popsaném Vanderzwalmenem et al. 2000 (Vanderzwalmen, Bertin et al., 2000). Nejprve byla embrya ekvilibrována (PBS s 17% HSA) po dobu 2 minut při teplotě místnosti. Poté byly přeneseny do prvního vitrifikačního roztoku (PBS + 14 % HSA + 10 % DMSO + 10 % ethylenglykol) na 2 minuty při teplotě místnosti a poté 30 sekund v druhém vitrifikačním roztoku (PBS + 12 % HSA + 20 % DMSO + 20% ethylenglykol + ficoll + sacharóza). Nakonec byla embrya co nejrychleji nanesena na Hemi-brčko v kapce přibližně 3 ul a ponořena přímo do kapalného dusíku. Poté byla polobrčko vložena do CBS-brčka.
   • Rozmrazování po vitrifikaci Polobrčko obsahující přesně jedno embryo bylo vytaženo z brčka CBS a okamžitě ponořeno do 3 ml prvního rozmrazovacího roztoku (PBS s 20% HSA) na 3 minuty při 36 °C. Poté bylo embryo postupně vystaveno na 2 minuty 3 dalším rozmrazovacím roztokům (0,5 M sacharóza, 0,25 M sacharóza a 0,125 M sacharóza, v daném pořadí). Embrya byla důkladně promyta a inkubována přes noc v médiu COOK blastocyst. Embrya jsou považována za „přežitá“, pokud alespoň 50 % blastomer přežilo vitrifikaci.
   • Postup pomalého zmrazování a rozmrazování Pro postup pomalého zmrazování a rozmrazování jsme použili komerční zmrazovací médium s HEPES pufrovaným Cookem (K-SICS 5000) s propandiolem a sacharózou jako kryoprotektivy.
3. Statistická analýza a výpočet výkonu

Na základě literatury (Rama Raju et al. 2005) očekáváme o 10 % vyšší míru implantace ve vitrifikační skupině (25 %) oproti skupině s pomalým zmrazováním (15 %) (Rama Raju, Haranath et al., 2005). Prokázat významný rozdíl na úrovni implantace nebo těhotenství s α=0,05 a silou (β) 0,80. Proto bychom potřebovali 270 přenesených embryí v každé skupině.