Vitrificação Versus Congelamento Lento de Embriões Humanos de Dia 3

1. Fundo

   Embora existam estudos que relataram gestações bem-sucedidas após a transferência de embriões vitrificados em estágio de clivagem, a maioria dos estudos se concentrou na vitrificação de oócitos e blastocistos. Até onde sabemos, há apenas um relato de um estudo prospectivo randomizado onde ambos os métodos de congelamento comuns - congelamento lento convencional e vitrificação (utilizando o sistema de loop de nylon com 40% de etilenoglicol) foram comparados para embriões de dia 3 (Rama Raju, Haranath et al., 2005). Eles relatam uma taxa de implantação e gravidez (14,9% e 35,0% respectivamente) com vitrificação, que é significativamente maior do que as taxas com o protocolo de congelamento lento (4,2% e 17,4% respectivamente). Ainda há necessidade de mais estudos randomizados que comparem os dois métodos de congelamento para embriões em estágio de clivagem.

   Há evidências na literatura de que o método de vitrificação usado no LUFc (hemi-straw) é superior ao método usado no ensaio randomizado de Rama Raju. Liebermann e Tucker compararam o sistema de hemi-canudo e crioloop para vitrificação de embriões de dia 3 derivados de zigotos fertilizados de forma anormal (Liebermann e Tucker, 2002). Eles não encontraram diferença estatística (p=0,07) na taxa de sobrevivência, mas o desenvolvimento após 24 horas foi estatisticamente melhor (p=0,002) usando hemi-canudos. Com base neste estudo, poderíamos até esperar resultados melhores do que o estudo de Rama Raju.

   Para refinar ainda mais o efeito da criopreservação de embriões em estágio de clivagem usando o sistema hemi-palha no potencial de desenvolvimento e implantação, a eficácia da vitrificação (20% EG e 20% DMSO) foi comparada com o congelamento lento.

2. Materiais e métodos

   • Pacientes Neste estudo prospectivo, todos os pacientes submetidos a FIV ou ICSI foram incluídos. A transferência de embriões frescos foi realizada no dia 3 após a inseminação. Todos os embriões excedentes que atingiram pelo menos o estágio de 6 células no dia 3 e tiveram menos de 20% de fragmentação foram considerados para criopreservação usando vitrificação ou congelamento lento.
   • Randomização Todos os embriões serão criopreservados por um dos dois métodos. A randomização ocorrerá no dia 3 após a inseminação. Por razões práticas, todos os embriões congelados no mesmo dia serão aleatoriamente designados para o mesmo método de congelamento.
   • Resultados da análise retrospectiva de dados A vitrificação tem sido usada como método padrão de criopreservação no LUFc desde setembro de 2004. Assim, tanto o congelamento lento quanto a vitrificação foram usados ​​para criopreservação de embriões de 3º dia. O método usado depende da carga de trabalho... então não houve randomização. Após uma análise retrospectiva desses dados (124 ciclos 43 no grupo lento e 81 no grupo vitrificação), notamos um aumento significativo na sobrevivência dos embriões após a vitrificação (81,2% no grupo vitrificação versus 45,8% no grupo lento ; p<0,0001). Não houve diferença significativa na taxa de prenhez entre os dois grupos (19,8% no grupo vitrificação versus 30,2% no grupo lento; p=NS).

   Até agora, vimos uma diferença notável na sobrevivência imediatamente ou 24h após o descongelamento, mas ainda não foi descoberta uma diferença clara na taxa de implantação, portanto, gostaríamos de iniciar um estudo randomizado para comprovar uma diferença significativa no nível de implantação ou gravidez.

   • Vitrificação de embriões humanos Nosso método foi baseado no procedimento descrito por Vanderzwalmen et al 2000 (Vanderzwalmen, Bertin et al., 2000). Primeiro os embriões foram equilibrados (PBS com 17% HSA) por 2 min em temperatura ambiente. Em seguida, foram transferidos para a primeira solução de vitrificação (PBS + 14% HSA + 10% DMSO + 10% etilenoglicol) por 2 min à temperatura ambiente seguido de 30 seg na segunda solução de vitrificação (PBS + 12% HSA + 20% DMSO + 20% etileno glicol + ficoll + sacarose). Finalmente, os embriões foram carregados o mais rápido possível no Hemi-straw em uma gota de aproximadamente 3 µl e imersos diretamente em nitrogênio líquido. Em seguida, o hemi-canudo foi inserido no canudo CBS.
   • Descongelamento após vitrificação O hemi-palha contendo exatamente um embrião foi retirado do canudo CBS e imediatamente imerso em 3 ml da primeira solução de descongelamento (PBS com 20% HSA) por 3 min a 36°C. Em seguida, o embrião foi exposto consecutivamente por 2 min às 3 outras soluções de descongelamento (0,5 M de sacarose, 0,25 M de sacarose e 0,125 M de sacarose, respectivamente). Os embriões foram cuidadosamente lavados e incubados durante a noite em meio COOK para blastocistos. Os embriões são considerados 'sobreviventes' se pelo menos 50% dos blastômeros sobreviverem ao procedimento de vitrificação.
   • Procedimento de congelamento e descongelamento lento Para o procedimento de congelamento e descongelamento lento, usamos o meio de congelamento comercial tamponado HEPES de Cook (K-SICS 5000) com propanodiol e sacarose como crioprotetores.
3. Análise estatística e cálculo de potência

Com base na literatura (Rama Raju et al 2005) esperamos uma taxa de implantação 10% maior no grupo de vitrificação (25%) versus o grupo de congelamento lento (15%) (Rama Raju, Haranath et al., 2005). Comprovar uma diferença significativa ao nível da implantação ou gravidez com α=0,05 e um poder (β) de 0,80. Portanto precisaríamos de 270 embriões transferidos em cada grupo.