인간 3일 차 배아의 유리화 대 느린 동결

1. 배경

   유리화 난할기 배아 이식 후 성공적인 임신을 보고한 연구들이 있지만, 대부분의 연구는 난모세포와 배반포의 유리화에 초점을 맞췄다. 우리가 아는 한, 무작위 전향적 연구에 대한 보고서는 단 한 건뿐이며 일반적인 냉동 방법인 기존의 느린 냉동 및 유리화(40% 에틸렌 글리콜이 포함된 나일론 루프 시스템 사용)가 3일차 배아에 대해 비교되었습니다(Rama Raju, Haranath 등, 2005). 그들은 유리화로 착상 및 임신율(각각 14,9% 및 35,0%)을 보고하는데, 이는 느린 동결 프로토콜(각각 4,2% 및 17,4%)의 비율보다 상당히 높습니다. 분열 단계 배아에 대한 두 동결 방법을 비교하는 더 많은 무작위 연구가 여전히 필요합니다.

   LUFc(hemi-straw)에서 사용된 유리화 방법이 Rama Raju의 무작위 시험에서 사용된 방법보다 우수하다는 문헌 증거가 있습니다. Liebermann과 Tucker는 비정상적으로 수정된 수정란에서 파생된 3일째 배아의 유리화를 위해 hemi-straw와 cryoloop 시스템을 모두 비교했습니다(Liebermann과 Tucker, 2002). 그들은 생존율에서 통계적 차이(p=0.07)를 발견하지 못했지만 24시간 후 발달은 헤미스트로우를 사용할 때 통계적으로 더 좋았습니다(p=0.002). 이 연구를 바탕으로 우리는 Rama Raju의 연구보다 더 나은 결과를 기대할 수 있습니다.

   hemi-straw 시스템을 사용하여 분열 단계 배아의 발달 및 착상 가능성에 대한 동결 보존 효과를 더욱 세분화하기 위해 유리화 효과(20% EG 및 20% DMSO)를 완속 동결과 비교했습니다.

2. 재료 및 방법

   • 환자 이 전향적 연구에는 사이에 IVF 또는 ICSI를 받은 모든 환자가 포함됩니다. 수정 후 3일째 신선한 배아 이식을 실시하였다. 3일째에 적어도 6세포기에 도달하고 20% 미만의 단편화된 모든 잉여 배아는 유리화 또는 저속 동결을 사용하는 동결 보존을 위해 고려되었습니다.
   • 무작위화 모든 배아는 두 가지 방법 중 하나로 냉동 보존됩니다. 무작위 배정은 수정 후 3일째에 이루어집니다. 실질적인 이유로 같은 날 냉동된 모든 배아는 동일한 냉동 방법에 무작위로 할당됩니다.
   • 후향적 데이터 분석 결과 유리화는 2004년 9월부터 LUFc에서 표준 동결 보존 방법으로 사용되었습니다. 따라서 3일차 배아의 동결보존에는 느린 동결과 유리화 방법이 모두 사용되었습니다. 사용되는 방법은 작업량에 따라 다르므로 무작위화는 없었습니다. 이 데이터를 후향적으로 분석한 결과(124주기 느린 그룹 43주기, 유리화 그룹 81주기), 유리화 후 배아의 생존율이 유의하게 증가했음을 확인했습니다(유리화 그룹 81.2% 대 느린 그룹 45.8%). ;p<0.0001). 두 그룹 사이에 임신율의 유의한 차이는 없었습니다(유리화 그룹에서 19.8% 대 느린 그룹에서 30.2%; p=NS).

   지금까지 해동 직후 또는 24시간 후 생존율에서 현저한 차이를 보였지만 아직 착상율의 뚜렷한 차이는 발견되지 않았기 때문에 착상 또는 임신 수준에서 유의미한 차이를 입증하기 위해 무작위 시험을 시작하고자 합니다.

   • 인간 배아의 유리화 우리의 방법은 Vanderzwalmen et al 2000(Vanderzwalmen, Bertin et al., 2000)에 의해 설명된 절차를 기반으로 합니다. 먼저 배아를 실온에서 2분 동안 평형화시켰다(17% HSA를 함유한 PBS). 그런 다음 RT에서 2분 동안 첫 번째 유리화 용액(PBS + 14% HSA + 10% DMSO + 10% 에틸렌 글리콜)으로 옮겨진 다음 두 번째 유리화 용액(PBS + 12% HSA + 20% DMSO + 20% 에틸렌 글리콜 + 피콜 + 자당). 마지막으로 배아를 약 3 μl의 액적으로 Hemi-straw에 가능한 한 빨리 로드하고 액체 질소에 직접 담급니다. 그 후 hemi-straw를 CBS-straw에 삽입하였다.
   • 유리화 후 해동 정확히 하나의 배아가 들어 있는 헤미-스트로우를 CBS 빨대에서 꺼내 즉시 3ml의 첫 번째 해동 용액(20% HSA가 포함된 PBS)에 36°C에서 3분 동안 담급니다. 그 후, 배아를 3개의 다른 해동 용액(각각 0.5M 수크로오스, 0.25M 수크로오스 및 0.125M 수크로오스)에 2분 동안 연속적으로 노출시켰다. 배아를 완전히 세척하고 COOK 배반포 배지에서 밤새 배양하였다. 할구의 50% 이상이 유리화 절차에서 살아남은 경우 배아는 '생존'한 것으로 간주됩니다.
   • 느린 동결 및 해동 절차 느린 동결 및 해동 절차를 위해 우리는 프로판디올 및 수크로즈를 동결 방지제로 사용하는 Cook의 HEPES 완충 상용 동결 배지(K-SICS 5000)를 사용했습니다.
3. 통계 분석 및 검정력 계산

문헌(Rama Raju et al 2005)에 근거하여 우리는 유리화 그룹(25%)에서 느린 동결 그룹(15%)에 비해 10% 더 높은 이식률을 기대합니다(Rama Raju, Haranath et al., 2005). α=0,05 및 0,80의 검정력(β)으로 착상 또는 임신 수준에서 유의미한 차이를 증명하기 위해. 따라서 우리는 각 그룹에 이식된 270개의 배아가 필요합니다.