Vitrificación versus congelación lenta de embriones humanos de día 3

1. Fondo

   Aunque hay estudios que reportaron embarazos exitosos después de la transferencia de embriones en etapa de escisión vitrificada, la mayoría de los estudios se enfocaron en la vitrificación de ovocitos y blastocistos. Hasta donde sabemos, solo existe un informe de un estudio prospectivo aleatorizado en el que se compararon los dos métodos de congelación comunes: la congelación lenta convencional y la vitrificación (utilizando el sistema de bucle de nailon con un 40 % de etilenglicol) para los embriones del día 3 (Rama Raju, Haranath et al., 2005). Reportan una tasa de implantación y embarazo (14,9% y 35,0% respectivamente) con vitrificación significativamente mayor que las tasas con el protocolo de congelación lenta (4,2% y 17,4% respectivamente). Todavía se necesitan más estudios aleatorizados que comparen ambos métodos de congelación para embriones en etapa de segmentación.

   Existe evidencia en la literatura de que el método de vitrificación utilizado en LUFc (hemi-paja) es superior al método utilizado en el ensayo aleatorizado de Rama Raju. Liebermann y Tucker compararon el sistema hemi-paja y crioloop para la vitrificación de embriones de 3 días derivados de cigotos anormalmente fertilizados (Liebermann y Tucker, 2002). No encontraron diferencia estadística (p = 0,07) en la tasa de supervivencia, pero el desarrollo después de 24 horas fue estadísticamente mejor (p = 0,002) usando hemi-pajuelas. Según este estudio, incluso esperaríamos mejores resultados que el estudio de Rama Raju.

   Para refinar aún más el efecto de la crioconservación de embriones en etapa de escisión utilizando el sistema hemi-paja sobre el potencial de desarrollo e implantación, se comparó la efectividad de la vitrificación (20 % de EG y 20 % de DMSO) con la congelación lenta.

2. Materiales y métodos

   • Pacientes En este estudio prospectivo se incluyen todos los pacientes que se sometieron a FIV o ICSI. La transferencia de embriones frescos se llevó a cabo el día 3 después de la inseminación. Todos los embriones sobrantes que alcanzaron al menos la etapa de 6 células en el día 3 y tenían menos del 20 % de fragmentación se consideraron para la crioconservación mediante vitrificación o congelación lenta.
   • Aleatorización Todos los embriones serán criopreservados por uno de los dos métodos. La aleatorización tendrá lugar el día 3 después de la inseminación. Por razones prácticas, todos los embriones congelados el mismo día se asignarán aleatoriamente al mismo método de congelación.
   • Resultados del análisis retrospectivo de datos La vitrificación se ha utilizado como método estándar de crioconservación en LUFc desde septiembre de 2004. Por lo tanto, tanto la congelación lenta como la vitrificación se habían utilizado para la criopreservación de embriones del día 3. El método utilizado depende de la carga de trabajo... por lo que no hubo aleatorización. Tras un análisis retrospectivo de estos datos (124 ciclos 43 en el grupo lento y 81 en el grupo de vitrificación), observamos un aumento significativo en la supervivencia de los embriones tras la vitrificación (81,2% en el grupo de vitrificación frente al 45,8% en el grupo lento). ;p<0,0001). No hubo diferencia significativa en la tasa de embarazo entre ambos grupos (19,8% en vitrificación versus 30,2% en grupo lento; p=NS).

   Hasta ahora vimos una diferencia notable en la supervivencia inmediatamente o 24 horas después de la descongelación, pero aún no se ha descubierto una diferencia clara en la tasa de implantación, por lo tanto, nos gustaría comenzar un ensayo aleatorio para probar una diferencia significativa a nivel de implantación o embarazo.

   • Vitrificación de embriones humanos Nuestro método se basó en el procedimiento descrito por Vanderzwalmen et al 2000 (Vanderzwalmen, Bertin et al., 2000). Primero se equilibraron los embriones (PBS con HSA al 17%) durante 2 min a temperatura ambiente. Luego se transfirieron a la primera solución de vitrificación (PBS + 14 % HSA + 10 % DMSO + 10 % etilenglicol) durante 2 min a TA seguido de 30 s en la segunda solución de vitrificación (PBS + 12 % HSA + 20 % DMSO + 20% etilenglicol + ficoll + sacarosa). Finalmente, los embriones se cargaron lo más rápido posible en la pajilla Hemi en una gota de aproximadamente 3 µl y se sumergieron directamente en nitrógeno líquido. Posteriormente, la hemi-pajuela se insertó en la pajilla CBS.
   • Descongelación después de la vitrificación La hemi-pajuela que contenía exactamente un embrión se extrajo de la pajilla CBS y se sumergió inmediatamente en 3 ml de la primera solución de descongelación (PBS con 20 % de HSA) durante 3 min a 36 °C. Posteriormente, el embrión se expuso consecutivamente durante 2 min a las otras 3 soluciones de descongelación (sacarosa 0,5 M, sacarosa 0,25 M y sacarosa 0,125 M, respectivamente). Los embriones se lavaron minuciosamente y se incubaron durante la noche en medio de blastocisto COOK. Los embriones se consideran "sobrevivientes" si al menos el 50 % de los blastómeros sobrevivieron al procedimiento de vitrificación.
   • Procedimiento de congelación y descongelación lenta Para el procedimiento de congelación y descongelación lenta se utilizó el medio de congelación comercial tamponado con HEPES de Cook (K-SICS 5000) con propandiol y sacarosa como crioprotectores.
3. Análisis estadístico y cálculo de potencia

Según la literatura (Rama Raju et al 2005), esperamos una tasa de implantación un 10 % mayor en el grupo de vitrificación (25 %) frente al grupo de congelación lenta (15 %) (Rama Raju, Haranath et al., 2005). Demostrar una diferencia significativa a nivel de implantación o embarazo con α=0,05 y una potencia (β) de 0,80. Por lo tanto necesitaríamos 270 embriones transferidos en cada grupo.