Ihmisen päivän 3 alkioiden lasittaminen vs. hidas jäätyminen

1. Tausta

   Vaikka on olemassa tutkimuksia, jotka raportoivat onnistuneista raskauksista lasitettujen pilkkoutumisvaiheen alkioiden siirron jälkeen, useimmat tutkimukset keskittyivät munasolujen ja blastokystien lasittamiseen. Sikäli kuin tiedämme, on olemassa vain yksi raportti satunnaistetusta prospektiivisestä tutkimuksesta, jossa molemmat yleiset pakastusmenetelmät - tavanomaista hidasta pakastusta ja lasitusta (käyttäen nailonsilmukkajärjestelmää, jossa on 40 % etyleeniglykolia) verrattiin päivän 3 alkioihin (Rama). Raju, Haranath et ai., 2005). He raportoivat implantaatio- ja raskausasteen (14,9 % ja 35,0 % vastaavasti) lasitettaessa, mikä on huomattavasti korkeampi kuin hitaan jäädytysprotokollalla (vastaavasti 4,2 % ja 17,4 %). Vielä tarvitaan enemmän satunnaistettuja tutkimuksia, joissa verrataan molempia pakastusmenetelmiä pilkkoutumisvaiheen alkioiden osalta.

   Kirjallisuudessa on näyttöä siitä, että LUFc:ssä (hemi-olki) käytetty lasitusmenetelmä on parempi kuin Rama Rajun satunnaistetussa kokeessa käytetty menetelmä. Liebermann ja Tucker vertasivat sekä hemi-olki- että kryoloop-järjestelmää epänormaalisti hedelmöittyneistä tsygooteista peräisin olevien päivän 3 alkioiden lasittamiseen (Liebermann ja Tucker, 2002). He eivät löytäneet tilastollista eroa (p = 0,07) eloonjäämisasteessa, mutta kehitys 24 tunnin jälkeen oli tilastollisesti parempi (p = 0,002) käytettäessä puolipillejä. Tämän tutkimuksen perusteella odotamme jopa parempia tuloksia kuin Rama Rajun tutkimuksesta.

   Pilkkomisvaiheen alkioiden kylmäsäilytyksen vaikutuksen parantamiseksi edelleen hemi-olkijärjestelmää käyttämällä kehitys- ja istutuspotentiaaliin lasittamisen tehokkuutta (20 % EG:tä ja 20 % DMSO:ta) verrattiin hitaaseen pakastukseen.

2. Materiaalit ja menetelmät

   • Potilaat Tässä prospektiivisessa tutkimuksessa mukana ovat kaikki potilaat, joille tehtiin IVF tai ICSI välillä. Tuore alkionsiirto suoritettiin päivänä 3 inseminoinnin jälkeen. Kaikki ylimääräiset alkiot, jotka saavuttivat vähintään 6-soluvaiheen päivänä 3 ja joiden fragmentoituminen oli alle 20 %, harkittiin kylmäsäilytystä käyttämällä joko lasitusta tai hidasta pakastusta.
   • Satunnaistaminen Kaikki alkiot kylmäsäilytetään jommallakummalla kahdesta menetelmästä. Satunnaistaminen tapahtuu päivänä 3 keinosiemennyksen jälkeen. Käytännön syistä kaikki samana päivänä pakastetut alkiot määrätään satunnaisesti samaan pakastusmenetelmään.
   • Tuloksia retrospektiivisestä data-analyysistä Lasittelua on käytetty LUFc:n vakiokylmäsäilytysmenetelmänä syyskuusta 2004 lähtien. Joten sekä hidasta pakastusta että lasitusta oli käytetty päivän 3 alkioiden kylmäsäilytykseen. Käytetty menetelmä riippuu työmäärästä… joten satunnaistamista ei tehty. Näiden tietojen retrospektiivisen analyysin jälkeen (124 sykliä 43 hitaassa ryhmässä ja 81 lasitusryhmässä) havaitsimme alkioiden eloonjäämisessä merkittävän kasvun lasituksen jälkeen (81,2 % lasitusryhmässä vs. 45,8 % hitaassa ryhmässä). p < 0,0001). Raskausasteessa ei ollut merkittävää eroa kummankaan ryhmän välillä (19,8 % lasitetussa ryhmässä vs. 30,2 % hitaassa ryhmässä; p=NS).

   Toistaiseksi olemme nähneet huomattavan eron eloonjäämisessä välittömästi tai 24 tuntia sulatuksen jälkeen, mutta selvää eroa implantaationopeudessa ei ole vielä löydetty, joten haluaisimme aloittaa satunnaistetun tutkimuksen, jolla todistetaan merkittävä ero implantaatio- tai raskaustasolla.

   • Ihmisalkioiden lasittaminen Menetelmämme perustui Vanderzwalmenin et al. 2000 (Vanderzwalmen, Bertin et al., 2000) kuvaamaan menettelyyn. Ensin alkiot tasapainotettiin (PBS ja 17 % HSA) 2 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Ne siirrettiin sitten ensimmäiseen lasitusliuokseen (PBS + 14 % HSA + 10 % DMSO + 10 % etyleeniglykoli) 2 minuutiksi huoneenlämpötilassa ja sen jälkeen 30 sekunniksi toiseen lasitusliuokseen (PBS + 12 % HSA + 20 % DMSO + 20 % etyleeniglykoli + ficoll + sakkaroosi). Lopuksi alkiot ladattiin mahdollisimman nopeasti Hemi-oljelle noin 3 µl:n pisaroina ja upotettiin suoraan nestetyppeen. Myöhemmin puolipilli työnnettiin CBS-pilliin.
   • Sulatus lasituksen jälkeen Puolipilli, jossa oli täsmälleen yksi alkio, vedettiin ulos CBS-pillistä ja upotettiin välittömästi 3 ml:aan ensimmäistä sulatusliuosta (PBS, jossa oli 20 % HSA:ta) 3 minuutiksi 36 °C:ssa. Sen jälkeen alkio altistettiin peräkkäin 2 minuutin ajan kolmelle muulle sulatusliuokselle (0,5 M sakkaroosi, 0,25 M sakkaroosi ja 0,125 M sakkaroosi, vastaavasti). Alkiot pestiin perusteellisesti ja inkuboitiin yön yli COOK-blastokystialustassa. Alkiot katsotaan "eloonjääneiksi", jos vähintään 50 % blastomeereistä selvisi lasitustoimenpiteestä.
   • Hidas pakastus ja sulatus Hitaaseen pakastus- ja sulatusmenetelmään käytimme Cookin HEPES-puskuroitua kaupallista pakastusväliainetta (K-SICS 5000) propandiolin ja sakkaroosin kanssa kryosuoja-aineina.
3. Tilastollinen analyysi ja teholaskenta

Kirjallisuuden perusteella (Rama Raju ym. 2005) odotamme 10 % korkeampaa implantaatiota lasitusryhmässä (25 %) verrattuna hitaan jäädytysryhmään (15 %) (Rama Raju, Haranath et al., 2005). Todistaa merkittävä ero implantaatio- tai raskaustasolla arvolla α=0,05 ja teholla (β) 0,80. Siksi tarvitsisimme 270 siirrettävää alkiota jokaiseen ryhmään.