慢性リンパ性白血病の個別化標的療法のためのペプチド薬物複合体

方法論 A: CLL 特異的ペプチド: (特定の目的 1) 全血サンプルは、ヘルシンキの許可番号に従って、健康なボランティアと新たに診断された未治療の CLL 患者から受け取ります。 0432-13-RMC。 (Rabin Medical Center) フォローアップ時および追加の 80 人の患者からのサンプルの取得は、現在進行中の追加のヘルシンキ申請でカバーされます。 リンパ球は Ficoll を使用して分離され、B 細胞は B 細胞分離キットを使用して分離されます。 健康なボランティアからの B 細胞と各患者からの分離細胞のアリコートは、後で使用するために凍結されます (以下の D を参照)。 残りの患者細胞は 2 つの画分に分けられます。 1 つは RNA の抽出に使用されます。 もう一方は、正常細胞に事前に吸収された「吸収された」ファージ ライブラリーにさらされます。 培養後、細胞を洗浄し、細胞膜に結合したファージを溶出・回収します。 次に細胞を溶解し、溶解物を保持します。 溶出液およびライセート中のファージ (それぞれ膜結合および内在化) は、大腸菌で別々に増幅されます。 増幅されたファージを単離し、NGS 用に DNA を調製します。 配列決定は、外部のコア施設 (テクニオン ゲノム センター) で行われます。

. B: ペプチド配列のバイオインフォマティクス分析 (特定の目的 1) I) ペプチドのシーケンシング: ファージ DNA ライブラリーからシークエンス リードを取得し、ハイスループット シーケンシング (イルミナ HiSeq システム) で生成および分析します。 品質管理チェックは、FastQC ツールを使用して実行されます。 Cutadapt ソフトウェア (23) を使用して、リードを処理してアダプターをトリミングし、いずれかの側からコンセンサス シーケンスを削除します。 残りのフラグメント タグにはペプチドの DNA 配列が含まれており、長さは 21 ヌクレオチドであると予想されます。 次に、Bioconductor フレームワークの BioString パッケージを使用してこれらのヌクレオチド配列を翻訳し、各ペプチド配列の出現回数を計算して、最も頻度の高いペプチドを見つけます。 ライブラリーサイズへの正規化に続いて、異なる患者ライブラリーからのペプチド配列カウントを比較して、共通の配列を見つけます。 ＣＬＬ細胞からうまく溶出されなかった膜結合クローンを除去するために、膜結合プール画分の配列を内在化プール画分から差し引く。 内在化プールに残っている配列は、ペプチド結合療法の候補として機能します。 次に、一変量ロジスティック回帰アプローチを使用して、ペプチド数と臨床的および遺伝的所見との可能な関連性をテストします。 臨床パラメーターが連続変数として扱われる場合、線形回帰が実装されます。 候補ペプチドは、それらが癌またはアポトーシスまたは血管新生などの他の疾患および状態に関連することが知られているかどうかを確認するために、PepBank データベース (24) に対して照会されます。 最後に、上記のバイオインフォマティクス分析手順を自動化するバイオインフォマティクス パイプライン スクリプトが開発されます。

II) 遺伝子発現パターンと融合遺伝子を検出するための RNA-seq:

RNA シーケンス解析の主な目的は、ペプチド シーケンスと臨床パラメーターと関連付けることができる特定の遺伝子発現パターンを検出することです。 これらの発現パターンは、細胞表面受容体の発現と細胞内経路活性の手がかりとなります。 患者は、B-CLL細胞によって内在化されたペプチド配列に基づいて分類され、差次的に発現する遺伝子を検出するために統計テストが実行されます。 経路分析は、細胞シグナル伝達カスケードにおけるペプチド受容体の可能な役割に光を当てる可能性のある機能的変化を推測するために行われます。 Trim galore ソフトウェアは、アダプターのトリミング、およびリードの末端から低品質の塩基を除去するために使用されます。 トリミングされた読み取りは、TopHat2 ソフトウェアを使用してヒトゲノム (hg38) にマッピングされます。 注釈付き遺伝子のそれぞれに重複する読み取りの数は、HT-seq python パッケージを使用してカウントされます。 Bioconductor フレームワーク内の DESeq は、Fisher の正確確率検定のバリアントを使用した正規化および発現差解析に使用されます。 一般的に適用可能な遺伝子セット濃縮（GAGE）法を適用して、アップレギュレートおよびダウンレギュレートされた経路を検出します。 RNA-seq は、患者のがん細胞における融合遺伝子イベントの検出にも使用され、疾患のモニタリングとして使用されるペプチド-色素コンジュゲートの感度をテストするための独立した検証方法として使用できます。 この目的のために、TopHat-fusion、defuse、および ChimeraScan の 3 つの異なるツールを使用して、融合転写産物を特定します。 前述のように低品質の候補を除去するためにいくつかのろ過ステップが適用され、3 つのツールすべてによって検出された候補のみが RT-PCR 検証用に選択されます。

C: ペプチドおよびコンジュゲートの合成 (特定の目的 1、2、3) ペプチドは、固相化学を使用して合成されます。 プロジェクトの第 1 段階では、すでに同定されている A20 マウス白血病細胞に特異的な 2 つのペプチド、すなわち HIS SER THR PRO SER SER PRO (ペプチド 1) と ASP SER SER LEU PHE ALA LEU (ペプチド 2) が合成されます。 後の段階で (下記参照)、選択されたヒト CLL 特異的ペプチドは、それらの配列が利用可能になるにつれて合成されます。 複数の反復読み取り (>5) (上記の B を参照) のみが選択されます (患者ごとに最大 3 つ)。これらは、細胞への取り込みを誘導する傾向が高いファージクローンを表すためです。 ペプチドは、ターゲットを絞った多薬物コンジュゲートを用いた以前の研究に基づいて、蛍光色素コンジュゲートと薬物コンジュゲートの両方として合成されます (21)。 高齢の CLL 患者の治療に使用される窒素マスタード Chlorambucil や、CLL 細胞のアポトーシスを誘導することが知られている微小管阻害剤 Combretastatin 4A など、作用機序の異なる薬剤を使用します (25)。 製品の純度と組成は、HPLC と LC/MS によって検証されます。 合成は外部サプライヤーによって行われます。

D: ペプチド特異性と PDC 活性の in vitro 検証: (具体的な目的 1、2、3) ペプチドの特異性: 標的ペプチドの特異性は、ペプチド-色素コンジュゲートを標的細胞および対照細胞とインキュベートすることによって実証されます。 マウス CLL システムでは、A20 細胞を標的細胞として使用し、正常なマウス脾臓リンパ球と、マウス皮膚および上皮細胞の初代培養を対照細胞として使用します。 ヒトＣＬＬ系では、患者ＣＬＬ細胞および正常ヒトリンパ球およびＨＵＶＥＣ細胞をそれぞれ標的細胞および対照細胞として使用する。 細胞を FITC 標識ペプチドとともに 4oC と 37oC の両方でインキュベートし、洗浄し、結合と内在化についてそれぞれ分析します。 結合は、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡による内在化によって評価されます。

ＰＤＣの細胞毒性：標的細胞および対照細胞を、遊離薬物またはＰＤＣの濃度を増加させながら（０～５０μＭ薬物当量）、２４時間および４８時間インキュベートする。 成長阻害率は、XTT アッセイによって評価されます。 次いで、細胞傷害性Ａ２０特異的ＰＤＣをインビボで評価する（以下のＥを参照）。

細胞培養システム: A20 細胞株は、FBS を添加した RPMI 培養培地で増殖および維持されます。 通常の初代培養は、選択培地で維持されます。 一方、培養中のヒト CLL 細胞の生存は、B 細胞 BCR の抗原刺激、CD40-CD40L 相互作用による T 細胞の助け、骨髄間質細胞由来の刺激など、いくつかの固有の微小環境要因に依存しています。 CXCL12 ケモカインと Toll-Like Receptor 9 の刺激。 これらの条件は、抗 IgM 培地への添加 (BCR を架橋するため)、CD40L を発現する線維芽細胞との共培養、組換え CXCL12 および CpG ジヌクレオチドのそれぞれの添加によって、in vitro で模倣されます (26)。 これらの条件は、患者のＣＬＬ細胞および正常ヒトリンパ球（対照）の凍結保存サンプルに対するヒトＰＤＣの特異性および有効性を試験するために使用される。

E: CLL の A20 マウスモデルを使用した動物研究 (特定の目的 3) CLL の治療のためのいくつかの抗体薬物コンジュゲートが使用されているか、またはテストされていますが (16)、これに対する PDC の有効性に関する公開された情報はほとんどありません。疾患。 したがって、アリエル大学機関動物倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って、CLL の動物モデルにおける A20 固有の PDC の動作を研究することを目指しています。 IL-47-08-13。 CLL 発生のキャリブレーションを検証するために、A20 細胞を Balb/c マウスに静脈内注射し、CLL 症状の発生を監視します。 通常、これには 40 ～ 50 日かかります。

研究 A): 現時点では、PDC による最も効果的な治療スケジュールについてほとんどわかっていません。 このため、公開された文献に基づいて、まず腫瘍を持たないマウスのグループに 1、7.5、または 15 mg/Kg の 1 つのクロラムブシルとコンブレタスタチンを腹腔内注射することにより、PDC の薬物に対する動物の全身耐性をテストします。 4A 3 週間、3 日おきに PDC を含む。 動物は、全身の罹患率および生存について監視される。 これらの結果に基づいて、2 つの PDC のそれぞれについて 2 つの濃度を比較するための最初の治療スケジュールが選択されます。 ＣＬＬの初期徴候を示す動物を処置し、生存およびＣＬＬ症状の発生を少なくとも７０日間およびさらに７０日間追跡する。

研究 B: 研究 A の結果を使用して、最も効果的な PDC をさらに研究します。 薬物複合体の PK は、試験 A で使用したものを含む 5 つの薬物濃度で投与することによって分析されます。血液サンプルは、0.25、0.5、1、2、5、10、および 24 時間で尾静脈から採取されます。 PDC は抽出され、内容物と完全性について LC/MS によって分析されます。 薬物濃度を HPLC で分析し、標準 PK パラメータの計算に使用します [Cmax; TCmax; T1/2]。 これらの実験に基づいて、治療期間中最大血中 PDC 濃度を維持することを目的とした追加の治療プロトコルが考案されます。 プロトコルは、動物の追加のグループでテストされます。 治療期間後、少なくともさらに70日間、CLL症状の生存および発症について動物を追跡する。

F: 動物および患者の全血中の CLL 細胞の検出。 (特定の目的 1 および 2) これらの実験の目的は、血液サンプル中の CLL 細胞を検出する CLL 特異的ペプチド-色素コンジュゲートの可能性を評価することです。 キャリブレーション実験は、3 つのレベルで実行されます。

1. 細胞のドーピング: 患者の CLL 細胞の凍結保存サンプルを、RPMI 培地または正常なヒト血液 (3 種類の濃度) に添加します。 上記のAで説明したように単離したB細胞を、適切なペプチド-色素コンジュゲートとともに37℃で30分間インキュベートします。 細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによってペプチド結合について分析する。 同様に、A20 細胞を正常なマウスの血液に添加し、A20 特異的ペプチド-色素コンジュゲートでテストします。
2. 動物モデル: 上記の動物モデルを使用して、腫瘍誘導期に週に 1 回、血液サンプルを採取します。 RBC溶解後、残りの細胞をペプチド-色素コンジュゲートと共にインキュベートし、洗浄し、フローサイトメトリーで分析します。 さらに、研究Bで生き残った動物から2週間に1回サンプルを採取し、最小残存疾患および再発について分析する。
3. 患者のフォローアップ：CLL患者の定期的なフォローアップ中に採取された血液サンプルのアリコートが使用されます。 細胞を適切なペプチド-色素コンジュゲートとともに37℃で30分間インキュベートします。 細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによってペプチド結合について分析する。

Ｇ：統計 ＰＤＣおよび遊離薬物の細胞毒性は、処理細胞対未処理細胞の成長阻害％を計算することによって評価される。 実験は 3 通で実行され、3 回繰り返されます。 動物実験では、カプラン・マイヤー曲線を使用して生存を評価します。 バイオインフォマティクス分析に関連する追加の統計は、上記のセクション 1.7-B で詳しく説明されています。