Peptidilääke-konjugaatit kroonisen lymfosyyttisen leukemian yksilölliseen, kohdennettuun hoitoon

Metodologia A: CLL-spesifiset peptidit: (Erityinen tavoite 1) Kokoverinäytteet otetaan terveiltä vapaaehtoisilta ja vasta diagnosoiduilta ja hoitamattomilta CLL-potilailta Helsingin lupamme nro. 0432-13-RMC. (Rabin Medical Center) Näytteiden hankinta seurannassa ja 80 lisäpotilaalta katetaan parhaillaan käynnissä olevilla Helsingin lisähakuilla. Lymfosyytit erotetaan käyttämällä Ficollia ja B-solut eristetään käyttämällä B-solujen eristyspakkausta. Terveiden vapaaehtoisten B-solut ja erä kustakin potilaasta eristetyistä soluista pakastetaan myöhempää käyttöä varten (katso D: alla). Loput potilassolut jaetaan kahteen fraktioon. Yhtä käytetään RNA:n uuttamiseen. Toinen altistetaan "absorboituneelle" faagikirjastolle, joka on esiabsorboitu normaaleihin soluihin. Inkuboinnin jälkeen solut pestään ja solukalvoon sitoutunut faagi eluoidaan ja otetaan talteen. Sitten solut hajotetaan ja lysaatti säilytetään. Eluaatissa ja lysaatissa olevat faagit (kalvoon sitoutuneet ja vastaavasti internalisoituneet) monistetaan erikseen E. colissa. Monistettu faagi eristetään ja DNA valmistetaan NGS:ää varten. Sekvensointi suoritetaan ulkoisessa ydinlaitoksessa (The Technion Genome Center).

. B: Peptidisekvenssien bioinformaattiset analyysit (erityinen tavoite 1) I) Peptidien sekvensointi: Sekvenssilukemat saadaan faagi-DNA-kirjastoista, jotka on luotu ja analysoitu suuren suorituskyvyn sekvensoinnilla (Illumina HiSeq -järjestelmä). Laadunvalvontatarkastukset suoritetaan FastQC-työkalulla. Lukemat käsitellään sovittimien trimmaamiseksi ja konsensussekvenssien poistamiseksi kummaltakin puolelta Cutadapt-ohjelmiston (23) avulla. Jäljelle jääneet fragmenttimerkit sisältävät peptidien DNA-sekvenssin ja niiden odotetaan olevan 21 nukleotidiä pitkiä. Seuraavaksi Bioconductor-kehyksen BioString-pakettia käytetään näiden nukleotidisekvenssien kääntämiseen, ja kunkin peptidisekvenssin esiintymisten lukumäärä lasketaan yleisimpien peptidien löytämiseksi. Kirjaston kokoon normalisoinnin jälkeen eri potilaskirjastojen peptidisekvenssimääriä verrataan yhteisten sekvenssien löytämiseksi. Sekvenssit kalvoon sitoutuneesta poolifraktiosta vähennetään internalisoidusta poolifraktiosta kalvoon sitoutuneiden kloonien poistamiseksi, joita ei ehkä ole onnistuneesti eluoitunut CLL-solusta. Sisäiseen pooliin jäävät sekvenssit toimivat ehdokkaina peptidikonjugaattihoitoon. Yksimuuttujalogistista regressiomenetelmää käytetään sitten testaamaan mahdollisia peptidimäärien yhteyksiä kliinisiin ja geneettisiin löydöksiin. Kun kliinisiä parametreja käsitellään jatkuvina muuttujina, lineaarinen regressio otetaan käyttöön. Ehdokaspeptidejä haetaan PepBank-tietokannasta (24) sen tarkistamiseksi, tiedetäänkö niiden liittyvän syöpään tai muihin sairauksiin ja tiloihin, kuten apoptoosiin tai angiogeneesiin. Lopuksi kehitetään bioinformatiikan putkiskripti, joka automatisoi yllä olevat bioinformatiikan analyysivaiheet.

II) RNA-seq geenien ilmentymismallien ja fuusiogeenien havaitsemiseksi:

RNA-sekvenssianalyysin päätavoitteena on havaita spesifisiä geeniekspressiomalleja, jotka voidaan korreloida peptidisekvenssien ja kliinisten parametrien kanssa. Nämä ilmentymismallit antavat vihjeitä solun pintareseptorin ilmentymisestä ja solunsisäisen reitin aktiivisuudesta. Potilaat jaetaan B-CLL-solujen internalisoimien peptidisekvenssien perusteella ja suoritetaan tilastollinen testi differentiaalisesti ilmentyneiden geenien havaitsemiseksi. Reittianalyysi suoritetaan funktionaalisten muutosten päättelemiseksi, jotka voivat varjostaa peptidireseptorien mahdollista roolia solun signalointikaskadissa. Trimmausohjelmistoa käytetään sovittimen trimmaamiseen ja heikkolaatuisten alustojen poistamiseen lukujen päistä. Leikatut lukemat kartoitetaan ihmisen genomiin (hg38) TopHat2-ohjelmistolla. Lukujen lukumäärä, jotka menevät päällekkäin kunkin annotoidun geenin kanssa, lasketaan käyttämällä HT-seq python -pakettia. Bioconductor-kehyksen sisällä olevaa DESeq:ia käytetään normalisointiin ja differentiaaliseen ilmentymisanalyysiin käyttäen Fisherin eksaktitestin variantteja. GAGE-menetelmää (Generly Applicable Gene-set Enrichment) käytetään havaitsemaan ylös ja alas säädellyt reitit. RNA-seqiä käytetään myös potilaan syöpäsolujen fuusiogeenitapahtumien havaitsemiseen ja sitä voidaan käyttää itsenäisenä validointimenetelmänä peptidi-värikonjugaatin herkkyyden testaamiseen, kuten sairauden seurantaan. Tätä tarkoitusta varten käytetään kolmea eri työkalua TopHat-fusion, defuse ja ChimeraScan tunnistamaan fuusiotranskriptit. Useita suodatusvaiheita käytetään huonolaatuisten ehdokkaiden poistamiseksi edellä kuvatulla tavalla, ja vain ne ehdokkaat, jotka kaikki kolme työkalua havaitsevat, valitaan RT-PCR-validointiin.

C: Peptidien ja konjugaattien synteesi (erityiset tavoitteet 1, 2, 3) Peptidit syntetisoidaan käyttämällä kiinteän faasin kemiaa. Projektin ensimmäisessä vaiheessa syntetisoidaan kaksi jo tunnistettua A20-hiiren leukemiasoluille spesifistä peptidiä, nimittäin HIS SER THR PRO SER SER PRO (peptidi 1) ja ASP SER SER LEU PHE ALA LEU (peptidi 2). Myöhemmissä vaiheissa (katso alla) valitut ihmisen CLL-spesifiset peptidit syntetisoidaan, kun niiden sekvenssit tulevat saataville. Vain peptidit valitaan useita toistuvia lukuja (> 5) (katso B edellä) (enintään 3 potilasta kohti), koska ne edustavat faagiklooneja, joilla on suurempi taipumus indusoida soluunottoa. Peptidit syntetisoidaan sekä fluoresoivina väriaine- että lääkekonjugaateina aiemman työmme perusteella kohdistettujen monilääkekonjugaattien kanssa (21). Tulemme käyttämään lääkkeitä, joilla on erilaiset vaikutusmekanismit, kuten typpisinappi Chlorambucil, jota käytetään iäkkäiden CLL-potilaiden hoitoon, ja mikrotubulusten estäjä Combretastatin 4A, jonka tiedetään indusoivan apoptoosia CLL-soluissa (25). Tuotteiden puhtaus ja koostumus varmistetaan HPLC:llä ja LC/MS:llä. Synteesin suorittaa ulkopuolinen toimittaja.

D: Peptidispesifisyyden ja PDC-aktiivisuuden validointi in vitro: (Spesifiset tavoitteet 1, 2, 3) Peptidien spesifisyys: Kohdennettujen peptidien spesifisyys osoitetaan inkuboimalla peptidi-värikonjugaatteja kohde- ja kontrollisolujen kanssa. Hiiren CLL-järjestelmässä A20-soluja käytetään kohdesoluina ja normaaleja hiiren pernan lymfosyyttejä ja hiiren ihon ja epiteelisolujen primääriviljelmiä käytetään kontrollisoluina. Ihmisen CLL-järjestelmässä kohdesoluina ja vertailusoluina käytetään potilaan CLL-soluja ja normaaleja ihmisen lymfosyyttejä ja HUVEC-soluja. Soluja inkuboidaan FITC-leimattujen peptidien kanssa sekä 4 oC:ssa että 37 oC:ssa, pestään ja analysoidaan sitoutumisen ja sisäistämisen suhteen. Sitoutuminen arvioidaan virtaussytometrialla ja internalisaatio konfokaalimikroskopialla.

PDC:iden sytotoksisuus: Kohde- ja kontrollisoluja inkuboidaan 24 ja 48 tuntia vapaan lääkkeen tai PDC:iden kasvavilla pitoisuuksilla (0-50 uM lääkeekvivalenttia). Kasvun estoprosentti arvioidaan XTT-määrityksellä. Sytotoksiset A20-spesifiset PDC:t arvioidaan sitten in vivo (katso E: alla).

Soluviljelyjärjestelmät: A20-solulinjaa kasvatetaan ja ylläpidetään FBS:llä täydennetyssä RPMI-viljelyväliaineessa. Normaalit primaariviljelmät ylläpidetään selektiivisellä alustalla. Toisaalta ihmisen CLL-solujen eloonjääminen viljelmässä riippuu useista ainutlaatuisista mikroympäristötekijöistä, mukaan lukien B-solun BCR:n antigeenistimulaatio, T-soluapu CD40-CD40L-vuorovaikutuksen kautta, stimulaatio luuytimen stroomasoluista. CXCL12-kemokiini ja Toll-Like Receptor 9:n stimulaatio. Näitä olosuhteita jäljitellään in vitro (26) lisäämällä viljelyväliaineeseen anti-IgM:tä (BCR:iden silloittamiseksi), yhteisviljelyllä CD40L:ää ilmentävien fibroblastien kanssa, lisäämällä rekombinantti-CXCL12- ja CpG-dinukleotideja, vastaavasti. Näitä olosuhteita käytetään ihmisen PDC:iden spesifisyyden ja tehokkuuden testaamiseen potilaan CLL-solujen ja normaaleiden ihmisen lymfosyyttien (verrokkien) kylmäsäilöttyjä näytteitä vastaan.

E: Eläintutkimukset CLL:n A20-hiirimallilla (erityinen tavoite 3) Vaikka useita CLL:n hoitoon tarkoitettuja vasta-aine-lääkekonjugaatteja on käytetty tai testataan parhaillaan (16), PDC-lääkkeiden tehokkuudesta tässä on vain vähän julkaistua tietoa. sairaus. Siksi pyrimme tutkimaan A20-spesifisten PDC:jemme käyttäytymistä CLL:n eläinmallissa Ariel University Institutional Animal Ethics Committeen hyväksymien protokollien mukaisesti, lupa nro. IL-47-08-13. CLL-kehityksen kalibroinnin validoimiseksi A20-soluja injektoidaan suonensisäisesti Balb/c-hiiriin ja CLL-oireiden kehittymistä seurataan. Yleensä tämä kestää 40-50 päivää.

Tutkimus A): Tässä vaiheessa tiedämme vähän tehokkaimmasta PDC-hoito-ohjelmasta. Tästä syystä ja julkaistun kirjallisuuden perusteella testaamme ensin eläinten systeemistä sietokykyä lääkkeille PDC:issä injektoimalla vatsaonteloon 1, 7,5 tai 15 mg/kg yhtä klorambusiilia ja kombretastatiinia hiirille, joilla ei ole kasvainta. 4A, joka sisältää PDC:tä joka kolmas päivä 3 viikon ajan. Eläimiä seurataan systeemisen sairastuvuuden ja eloonjäämisen suhteen. Näiden tulosten perusteella valitaan ensimmäinen hoitoaikataulu, jossa verrataan kahta pitoisuutta kummallekin kahdelle PDC:lle. Eläimiä, joilla on ensimmäisiä CLL-oireita, hoidetaan ja niitä seurataan eloonjäämisen ja CLL-oireiden kehittymisen suhteen vähintään ja vielä 70 päivän ajan.

Tutkimus B: Tehokkainta PDC:tä tutkitaan edelleen käyttämällä tutkimuksen A tuloksia. Lääkekonjugaatin PK analysoidaan antamalla sitä viidessä lääkepitoisuudessa, mukaan lukien tutkimuksessa A käytetty. Verinäytteet otetaan häntälaskimosta 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10 ja 24 tunnin kohdalla. PDC poimitaan ja analysoidaan LC/MS:llä sisällön ja eheyden suhteen. Lääkepitoisuudet analysoidaan HPLC:llä ja niitä käytetään standardien PK-parametrien laskemiseen [Cmax; TCmax; T1/2]. Näiden kokeiden perusteella suunnitellaan lisähoitoprotokolla, jonka tarkoituksena on ylläpitää maksimi veren PDC-pitoisuus koko hoitojakson ajan. Protokollaa testataan toisella eläinryhmällä. Hoitojakson jälkeen eläimiä seurataan eloonjäämisen ja CLL-oireiden kehittymisen suhteen vähintään ja vielä 70 päivää.

F: CLL-solujen havaitseminen eläimen ja potilaan kokoverestä. (Erityiset tavoitteet 1 ja 2) Näiden kokeiden tavoitteena on arvioida CLL-spesifisten peptidi-värikonjugaattien potentiaalia havaita CLL-soluja verinäytteistä. Kalibrointikokeet suoritetaan kolmella tasolla.

1. Solujen doping: Potilaan CLL-solujen kylmäsäilötyt näytteet lisätään joko RPMI-viljelyalustaan ​​tai normaaliin ihmisen vereen (kolmessa pitoisuudessa). Edellä kohdassa A kuvatulla tavalla eristettyjä B-soluja inkuboidaan sopivan peptidi-värikonjugaatin kanssa 30 minuuttia 37 °C:ssa. Solut pestään ja analysoidaan peptidin sitoutumisen suhteen virtaussytometrialla. Samalla tavalla A20-soluja lisätään normaaliin hiiren vereen ja testataan A20-spesifisillä peptidi-värikonjugaateilla.
2. Eläinmalli: Käyttämällä edellä kuvattua eläinmallia, verinäytteitä otetaan kerran viikossa kasvaimen induktiovaiheen aikana. Punasolujen hajoamisen jälkeen jäljellä olevia soluja inkuboidaan peptidi-värikonjugaattien kanssa, pestään ja analysoidaan virtaussytometrialla. Lisäksi tutkimuksesta B selviytyneistä eläimistä otetaan näytteitä kerran kahdessa viikossa ja analysoidaan minimaalisen jäännöstaudin ja uusiutumisen varalta.
3. Potilaan seuranta: KLL-potilaiden rutiiniseurannan aikana otettuja verinäytteiden alikvootteja käytetään. Soluja inkuboidaan sopivan peptidi-värikonjugaatin kanssa 30 minuuttia 37 °C:ssa. Solut pestään ja analysoidaan peptidin sitoutumisen suhteen virtaussytometrialla.

G: Tilastot PDC:iden ja vapaan lääkkeen sytotoksisuus arvioidaan laskemalla käsiteltyjen solujen kasvun esto-% verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Kokeet suoritetaan kolmena kappaleena ja toistetaan kolmesti. Eläintutkimuksissa eloonjäämistä arvioidaan Kaplan-Meier-käyrien avulla. Bioinformaattisiin analyyseihin liittyvät lisätilastot on kuvattu yksityiskohtaisesti edellä kohdassa 1.7-B.