Konjugáty peptid-lék pro personalizovanou, cílenou terapii chronické lymfocytární leukémie

Metodika A: Peptidy specifické pro CLL: (Specifický cíl 1) Vzorky plné krve se odebírají od zdravých dobrovolníků a nově diagnostikovaných a neléčených pacientů s CLL podle našeho Helsinského povolení č. 0432-13-RMC. (Rabin Medical Center) Získávání vzorků při sledování a od dalších 80 pacientů bude pokryto dalšími helsinskými podáními, která nyní probíhají. Lymfocyty se oddělí pomocí Ficoll a B buňky se izolují pomocí izolačního kitu B-buněk. B-buňky od zdravých dobrovolníků a alikvot těchto izolovaných buněk od každého pacienta se zmrazí pro pozdější použití (viz D: níže). Zbývající buňky pacienta jsou rozděleny do dvou frakcí. Jeden se používá pro extrakci RNA. Druhý je vystaven "absorbované" fágové knihovně předem absorbované na normálních buňkách. Po inkubaci se buňky promyjí a fág navázaný na buněčnou membránu se eluuje a izoluje. Buňky se poté lyžují a lyzát se zadrží. Fág v eluátu a lyzátu (vázaný na membránu a internalizovaný v daném pořadí) jsou amplifikovány odděleně v E. coli. Amplifikovaný fág se izoluje a DNA se připraví pro NGS. Sekvenování se provádí v externím základním zařízení (The Technion Genome Center).

. B: Bioinformatické analýzy peptidových sekvencí (Specifický cíl 1) I) Sekvenování peptidů: Čtení sekvencí se získávají z knihoven fágové DNA generovaných a analyzovaných pomocí vysoce výkonného sekvenování (systém Illumina HiSeq). Kontroly kvality se provádějí pomocí nástroje FastQC. Čtení se zpracují k oříznutí adaptérů a odstranění konsenzuálních sekvencí z obou stran pomocí softwaru Cutadapt (23). Zbývající fragmentové značky obsahují sekvenci DNA peptidů a očekává se, že budou mít délku 21 nukleotidů. Dále se k překladu těchto nukleotidových sekvencí použije balíček BioString z rámce Bioconductor a vypočítá se počet výskytů každé peptidové sekvence, aby se našly nejčastější peptidy. Po normalizaci na velikost knihovny jsou počty peptidových sekvencí z různých knihoven pacientů porovnány za účelem nalezení společných sekvencí. Sekvence ze spojené frakce vázané na membránu se odečítají od internalizované spojené frakce, aby se odstranily klony vázané na membránu, které nemusely být úspěšně eluovány z buněk CLL. Sekvence zbývající v internalizovaném poolu slouží jako kandidáti pro terapii peptid-konjugát. Jednorozměrný přístup logistické regrese pak bude použit k testování možných asociací počtu peptidů s klinickými a genetickými nálezy. Když jsou klinické parametry považovány za spojité proměnné, bude implementována lineární regrese. Kandidátské peptidy budou dotazovány v databázi PepBank (24), aby se ověřilo, zda je známo, že souvisejí s rakovinou nebo jinými nemocemi a stavy, jako je apoptóza nebo angiogeneze. Nakonec bude vyvinut skript bioinformatického potrubí, který automatizuje výše uvedené kroky bioinformatické analýzy.

II) RNA-seq pro detekci vzorců genové exprese a fúzních genů:

Hlavním cílem analýzy RNA-seq je detekovat specifické vzorce genové exprese, které mohou být korelovány s peptidovými sekvencemi a klinickými parametry. Tyto vzorce exprese poskytnou vodítko k expresi receptoru na povrchu buněk a aktivitě intracelulární dráhy. Pacienti budou rozděleni na základě peptidových sekvencí internalizovaných B-CLL buňkami a bude proveden statistický test za účelem detekce odlišně exprimovaných genů. Bude provedena analýza dráhy za účelem odvození funkčních změn, které mohou zastínit možnou roli peptidových receptorů v buněčné signální kaskádě. Software Trim galore bude použit pro ořezávání adaptéru a pro odstranění nekvalitních bází z konců čtení. Oříznuté hodnoty budou mapovány do lidského genomu (hg38) pomocí softwaru TopHat2. Počet čtení překrývajících se s každým z anotovaných genů bude počítán pomocí balíčku HT-seq python. DESeq v rámci Bioconductor framework bude použit pro normalizaci a analýzu diferenciální exprese pomocí variant Fisherova exaktního testu. Pro detekci up a down-regulovaných drah bude použita metoda Generally Applicable Gene-set Enrichment (GAGE). RNA-seq se také používá k detekci fúzních genových událostí v rakovinných buňkách pacienta a může být použita jako nezávislá validační metoda pro testování citlivosti konjugátu peptid-barvivo používaného jako pro monitorování onemocnění. Za tímto účelem budou k identifikaci fúzních transkriptů použity tři různé nástroje TopHat-fusion, defuse a ChimeraScan. Bude použito několik kroků filtrace, aby se odstranily kandidáty nízké kvality, jak bylo popsáno výše, a pro validaci RT-PCR budou vybráni pouze kandidáti detekovaní všemi třemi nástroji.

C: Syntézy peptidů a konjugátů (Specifické cíle 1,2,3) Peptidy budou syntetizovány pomocí chemie na pevné fázi. V první fázi projektu budou syntetizovány dva již identifikované peptidy specifické pro myší leukemické buňky A20, a to HIS SER THR PRO SER SER PRO (peptid 1) a ASP SER SER LEU PHE ALA LEU (peptid 2). V pozdějších fázích (viz níže) budou syntetizovány vybrané lidské CLL specifické peptidy, jakmile budou jejich sekvence dostupné. Budou vybrány pouze peptidy s vícenásobnými opakováními (>5) (viz B výše) (maximálně 3 na pacienta), protože představují fágové klony s větší náchylností k indukci vychytávání do buněk. Peptidy budou syntetizovány jako fluorescenční konjugáty barviv a léčiv na základě naší předchozí práce s cílenými konjugáty více léčiv (21). Použijeme léky s různými mechanismy účinku, jako je dusíkatý yperit Chlorambucil používaný k léčbě starších pacientů s CLL a inhibitor mikrotubulů Combretastatin 4A, o kterém je známo, že indukuje apoptózu v buňkách CLL (25). Čistota a složení produktů budou ověřeny pomocí HPLC a LC/MS. Syntézy bude provádět externí dodavatel.

D: In vitro validace peptidové specifičnosti a aktivity PDC: (Specifické cíle 1, 2, 3) Specifičnost peptidů: Specifičnost cílových peptidů bude prokázána inkubací konjugátů peptid-barvivo s cílovými a kontrolními buňkami. Pro myší systém CLL budou buňky A20 použity jako cílové buňky a normální myší slezinné lymfocyty a primární kultury myších kožních a epiteliálních buněk budou použity jako kontrolní buňky. Pro lidský CLL systém budou jako cílové a kontrolní buňky použity pacientské CLL buňky a normální lidské lymfocyty a HUVEC buňky. Buňky budou inkubovány s FITC-značenými peptidy při 4 °C a 37 °C, promyty a analyzovány na vazbu a internalizaci, v daném pořadí. Vazba bude hodnocena průtokovou cytometrií a internalizace konfokální mikroskopií.

Cytotoxicita PDC: Cílové a kontrolní buňky budou inkubovány po dobu 24 a 48 hodin se zvyšujícími se koncentracemi (0-50uM lékových ekvivalentů) volného léku nebo PDC. Procentuální inhibice růstu bude hodnocena testem XTT. Cytotoxické A20 specifické PDC pak budou hodnoceny in vivo (viz E: níže).

Systémy buněčné kultury: Buněčná linie A20 se pěstuje a udržuje v kultivačním médiu RPMI doplněném FBS. Normální primární kultury jsou udržovány se selektivním médiem. Na druhé straně je přežití lidských CLL buněk v kultuře závislé na několika jedinečných mikroprostředích, včetně stimulace B-buněk BCR antigenem, pomoci T-buněk prostřednictvím interakce CD40-CD40L, stimulace ze stromálních buněk kostní dřeně. Chemokin CXCL12 a stimulace Toll-like receptoru 9. Tyto podmínky budou napodobeny in vitro (26) přidáním anti-IgM do kultivačního média (pro zesíťování BCR), kokultivací s fibroblasty exprimujícími CD40L, přidáním rekombinantních dinukleotidů CXCL12 a CpG, v daném pořadí. Tyto podmínky budou použity k testování specificity a účinnosti lidských PDC proti kryokonzervovaným vzorkům buněk CLL pacientů a normálních lidských lymfocytů (kontroly).

E: Studie na zvířatech s použitím myšího modelu A20 CLL (Specifický cíl 3) I když bylo použito nebo se testuje několik konjugátů protilátka-léčivo pro léčbu CLL (16), existuje jen málo publikovaných informací o účinnosti PDC v tomto ohledu. choroba. Proto se snažíme studovat chování našich PDC specifických pro A20 na zvířecím modelu CLL, podle protokolů schválených Institucionálním výborem pro etiku zvířat Ariel University, povolení č. IL-47-08-13. Pro ověření kalibrace rozvoje CLL budou buňky A20 injikovány intravenózně myším Balb/c a bude monitorován vývoj symptomů CLL. Obvykle to trvá 40-50 dní.

Studie A): V tuto chvíli víme jen málo o nejúčinnějším léčebném schématu s PDC. Z tohoto důvodu a na základě publikované literatury nejprve otestujeme systémovou toleranci zvířat k lékům v PDC tak, že skupinám myší bez nádoru intraperitoneálně podáme 1, 7,5 nebo 15 mg/kg jednoho chlorambucilu a kombretastatinu. 4A obsahující PDC každý třetí den po dobu 3 týdnů. Zvířata budou sledována na systémovou morbiditu a přežití. Na základě těchto výsledků bude vybrán počáteční léčebný plán pro porovnání dvou koncentrací pro každou ze dvou PDC. Zvířata vykazující počáteční známky CLL budou léčena a sledována z hlediska přežití a rozvoje symptomů CLL po dobu alespoň a dalších 70 dnů.

Studie B: Pomocí výsledků studie A bude dále studována nejúčinnější PDC. PK konjugátu léčiva bude analyzována podáním v 5 koncentracích léčiva, včetně koncentrace použité pro studii A. Vzorky krve budou odebírány z ocasní žíly v 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10 a 24 hodin. PDC bude extrahováno a analyzováno pomocí LC/MS na obsah a integritu. Koncentrace léčiva budou analyzovány pomocí HPLC a použity k výpočtu standardních PK parametrů [Cmax; TCmax; T1/2]. Na základě těchto experimentů bude navržen další léčebný protokol zaměřený na udržení maximální koncentrace PDC v krvi po dobu léčby. Protokol bude testován na další skupině zvířat. Po období léčby budou zvířata sledována z hlediska přežití a rozvoje symptomů CLL po dobu alespoň a dalších 70 dnů.

F: Detekce buněk CLL v plné krvi zvířat a pacientů. (Specifické cíle 1 a 2) Cílem těchto experimentů je posoudit potenciál CLL-specifických konjugátů peptid-barvivo pro detekci CLL buněk ve vzorcích krve. Kalibrační experimenty budou prováděny na třech úrovních.

1. Buněčný doping: Kryokonzervované vzorky buněk CLL pacientů budou přidány buď do kultivačního média RPMI nebo do normální lidské krve (ve třech koncentracích). B-buňky izolované jak je popsáno v A výše, budou inkubovány s vhodným konjugátem Peptid-barvivo po dobu 30 minut při 37 °C. Buňky budou promyty a analyzovány na vazbu peptidu průtokovou cytometrií. Podobně budou buňky A20 přidány do normální myší krve a testovány s konjugáty peptid-barvivo specifické pro A20.
2. Zvířecí model: Za použití zvířecího modelu popsaného výše budou vzorky krve odebírány jednou týdně během fáze indukce nádoru. Po lýze RBC budou zbývající buňky inkubovány s konjugáty peptid-barvivo, promyty a analyzovány průtokovou cytometrií. Kromě toho budou jednou/čtrnáct dní odebírány vzorky zvířatům, která přežila studii B, a analyzovány na minimální reziduální onemocnění a recidivu.
3. Sledování pacientů: Budou použity alikvotní vzorky krve odebrané během rutinního sledování pacientů s CLL. Buňky budou inkubovány s vhodným konjugátem Peptid-barvivo po dobu 30 minut při 37 °C. Buňky budou promyty a analyzovány na vazbu peptidu průtokovou cytometrií.

G: Statistika Cytotoxicita PDC a volného léčiva bude hodnocena výpočtem % inhibice růstu ošetřených buněk oproti neošetřeným buňkám. Experimenty budou provedeny v triplikátech a budou se opakovat třikrát. Ve studiích na zvířatech bude přežití hodnoceno pomocí Kaplan-Meierových křivek. Další statistiky související s bioinformatickými analýzami jsou podrobně popsány výše v části 1.7-B.