Conjugados peptídeo-droga para terapia personalizada e direcionada da leucemia linfocítica crônica

Metodologia A: Peptídeos específicos de CLL: (objetivo específico 1) Amostras de sangue total são recebidas de voluntários saudáveis ​​e pacientes recém-diagnosticados e não tratados de CLL de acordo com nossa licença de Helsinque no. 0432-13-RMC. (Rabin Medical Center) A aquisição de amostras no acompanhamento e de 80 pacientes adicionais será coberta por envios adicionais de Helsinque agora em andamento. Os linfócitos são separados usando Ficoll e as células B isoladas usando um kit de isolamento de células B. As células B dos voluntários saudáveis ​​e uma alíquota dessas células isoladas de cada paciente são congeladas para uso posterior (ver D: abaixo). As células restantes do paciente são divididas em duas frações. Um é usado para extração de RNA. O outro é exposto a uma biblioteca de fagos "absorvida" pré-absorvida em células normais. Após a incubação, as células são lavadas e os fagos ligados à membrana celular são eluídos e recuperados. As células são então lisadas e o lisado retido. Os fagos no eluato e lisado (respectivamente ligados à membrana e internalizados) são amplificados separadamente em E.coli. Os fagos amplificados são isolados e o DNA preparado para NGS. O sequenciamento é realizado em uma instalação central externa (The Technion Genome Center).

. B: Análises bioinformáticas de sequências de peptídeos (objetivo específico 1) I) Sequenciamento de peptídeos: As leituras de sequências são obtidas de bibliotecas de DNA de fagos geradas e analisadas com sequenciamento de alto rendimento (sistema Illumina HiSeq). As verificações de controle de qualidade são realizadas usando a ferramenta FastQC. As leituras são processadas para ajustar os adaptadores e remover as sequências de consenso de ambos os lados usando o software Cutadapt (23). As marcas de fragmentos restantes contêm a sequência de DNA dos peptídeos e devem ter 21 nucleotídeos de comprimento. Em seguida, o pacote BioString da estrutura Bioconductor é usado para traduzir essas sequências de nucleotídeos e o número de ocorrências de cada sequência peptídica é calculado para encontrar os peptídeos mais frequentes. Após a normalização para o tamanho da biblioteca, as contagens de sequência de peptídeos de diferentes bibliotecas de pacientes são comparadas para encontrar sequências comuns. As sequências da fração pool ligada à membrana são subtraídas da fração pool internalizada de modo a remover os clones ligados à membrana que podem não ter sido eluídos com sucesso da célula CLL. As sequências remanescentes no pool internalizado servem como candidatas para terapia de conjugado de peptídeo. Uma abordagem de regressão logística univariada será então usada para testar possíveis associações de contagens de peptídeos com achados clínicos e genéticos. Quando os parâmetros clínicos são tratados como variáveis ​​contínuas, a regressão linear será implementada. Os peptídeos candidatos serão consultados no banco de dados PepBank (24) para verificar se são conhecidos por estarem relacionados ao câncer ou outras doenças e condições, como apoptose ou angiogênese. Por fim, um script de pipeline bioinformática será desenvolvido automatizando as etapas de análise bioinformática acima.

II) RNA-seq para detectar padrões de expressão gênica e genes de fusão:

O principal objetivo da análise de RNA-seq é detectar padrões de expressão gênica específicos que podem ser correlacionados com sequências peptídicas e parâmetros clínicos. Esses padrões de expressão darão pistas sobre a expressão do receptor da superfície celular e a atividade da via intracelular. Os pacientes serão divididos com base nas sequências peptídicas internalizadas pelas células B-CLL, e um teste estatístico será realizado para detectar genes diferencialmente expressos. A análise de vias será realizada para inferir alterações funcionais que possam esclarecer o possível papel dos receptores peptídicos na cascata de sinalização celular. O software Trim Galore será usado para o ajuste do adaptador e para remover bases de baixa qualidade das extremidades das leituras. As leituras aparadas serão mapeadas para o genoma humano (hg38) usando o software TopHat2. O número de leituras que se sobrepõem a cada um dos genes anotados será contado usando o pacote python HT-seq. DESeq dentro da estrutura Bioconductor será usado para normalização e análise de expressão diferencial usando variantes do teste exato de Fisher. O método de enriquecimento de conjunto de genes geralmente aplicável (GAGE) será aplicado para detectar vias reguladas para cima e para baixo. O RNA-seq também é usado para detectar eventos gênicos de fusão nas células cancerígenas do paciente e pode ser usado como um método de validação independente para testar a sensibilidade do conjugado peptídeo-corante usado para monitoramento de doenças. Para este fim, três ferramentas diferentes TopHat-fusion, defuse e ChimeraScan serão usadas para identificar transcrições de fusão. Várias etapas de filtragem serão aplicadas para remover os candidatos de baixa qualidade, conforme descrito anteriormente, e apenas os candidatos detectados pelas três ferramentas serão escolhidos para validação RT-PCR.

C: Síntese de Peptídeos e conjugados (Objetivos específicos 1,2,3) Os peptídeos serão sintetizados usando química de fase sólida. Na primeira fase do projeto, serão sintetizados os dois peptídeos específicos para células leucêmicas de camundongos A20 já identificados, a saber, HIS SER THR PRO SER SER PRO (Peptídeo 1) e ASP SER SER LEU PHE ALA LEU (Peptídeo 2). Em estágios posteriores (ver abaixo), peptídeos específicos de CLL humana selecionados serão sintetizados à medida que suas sequências se tornam disponíveis. Somente peptídeos com leituras repetidas múltiplas (>5) (ver B acima) serão selecionados (máximo de 3 por paciente), pois representam clones de fagos com maior propensão para induzir a absorção nas células. Os peptídeos serão sintetizados como corantes fluorescentes e conjugados de drogas com base em nosso trabalho anterior com conjugados multi-drogas direcionados (21). Utilizaremos drogas com diferentes mecanismos de ação, como a mostarda nitrogenada Clorambucil, usada no tratamento de pacientes idosos com LLC, e o inibidor de microtúbulos Combretastatina 4A, conhecido por induzir apoptose em células LLC (25). A pureza e composição dos produtos serão verificadas por HPLC e LC/MS. As sínteses serão realizadas por um fornecedor externo.

D: Validação in vitro da especificidade do peptídeo e da atividade do PDC: (objetivos específicos 1, 2, 3) Especificidade dos peptídeos: A especificidade dos peptídeos de direcionamento será demonstrada pela incubação de conjugados peptídeo-corante com células alvo e controles. Para o sistema de CLL de camundongo, células A20 serão usadas como células-alvo e linfócitos esplênicos de camundongos normais e culturas primárias de pele de camundongo e células epiteliais serão usadas como células de controle. Para o sistema CLL humano, células CLL de pacientes e linfócitos humanos normais e células HUVEC serão usadas como alvo e células de controle, respectivamente. As células serão incubadas com peptídeos marcados com FITC a 4oC e 37oC, lavadas e analisadas para ligação e internalização, respectivamente. A ligação será avaliada por citometria de fluxo e a internalização por microscopia confocal.

Citotoxicidade de PDCs: As células-alvo e de controle serão incubadas por 24 e 48 horas com concentrações crescentes (equivalentes de droga 0-50uM) de droga livre ou PDCs. A porcentagem de inibição do crescimento será avaliada pelo ensaio XTT. Os PDCs citotóxicos específicos de A20 serão então avaliados in vivo (ver E: abaixo).

Sistemas de cultura celular: A linha celular A20 é cultivada e mantida em meio de cultura RPMI suplementado com FBS. Culturas primárias normais são mantidas com meio seletivo. Por outro lado, a sobrevivência de células humanas CLL em cultura depende de vários fatores microambientais únicos, incluindo estimulação antigênica de BCR de células B, ajuda de células T por meio da interação CD40-CD40L, estimulação de células estromais derivadas da medula óssea Quimiocina CXCL12 e estimulação do Toll-Like Receptor 9. Estas condições serão mimetizadas in vitro (26) pela adição ao meio de cultura de anti-IgM (para reticular os BCRs), co-cultura com fibroblastos expressando CD40L, adição de dinucleotídeos recombinantes CXCL12 e CpG, respectivamente. Essas condições serão usadas para testar a especificidade e eficácia de PDCs humanos contra amostras criopreservadas de células de pacientes CLL e linfócitos humanos normais (controles).

E: Estudos em animais usando modelo de camundongo A20 de CLL (objetivo específico 3) Embora vários conjugados anticorpo-droga para o tratamento de CLL tenham sido usados ​​ou estejam sendo testados (16), há pouca informação publicada sobre a eficácia de PDCs para este doença. Portanto, pretendemos estudar o comportamento de nossos PDCs específicos A20 em um modelo animal de LLC, de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Ética Animal Institucional da Ariel University, permissão no. IL-47-08-13. Para validar a calibração do desenvolvimento da LLC, células A20 serão injetadas por via intravenosa em camundongos Balb/c e o desenvolvimento dos sintomas da LLC será monitorado. Normalmente, isso leva entre 40-50 dias.

Estudo A): Neste ponto, sabemos pouco sobre o esquema de tratamento mais eficaz com PDCs. Por esta razão, e com base na literatura publicada, vamos primeiro testar a tolerância sistêmica dos animais às drogas nas PDCs, injetando grupos de camundongos não portadores de tumor por via intraperitoneal com 1, 7,5 ou 15 mg/Kg de um Clorambucil e Combretastatina 4A contendo PDC a cada três dias durante 3 semanas. Os animais serão monitorados quanto à morbidade sistêmica e sobrevivência. Com base nesses resultados, um esquema de tratamento inicial será selecionado para comparar duas concentrações para cada um dos dois PDCs. Os animais que apresentarem sinais iniciais de LLC serão tratados e acompanhados quanto à sobrevivência e desenvolvimento de sintomas de LLC por pelo menos 70 dias adicionais.

Estudo B: Usando os resultados do Estudo A, o PDC mais eficaz será estudado mais a fundo. A PK do conjugado de droga será analisada pela administração em 5 concentrações de droga, incluindo a usada para o Estudo A. Amostras de sangue serão coletadas da veia da cauda em 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10 e 24 horas. O PDC será extraído e analisado por LC/MS quanto ao conteúdo e integridade. As concentrações de drogas serão analisadas por HPLC e usadas para calcular os parâmetros PK padrão [Cmax; TCmáx; T1/2]. Com base nesses experimentos, um protocolo de tratamento adicional será elaborado visando manter uma concentração sanguínea máxima de PDC durante o período de tratamento. O protocolo será testado em um grupo adicional de animais. Após o período de tratamento, os animais serão acompanhados quanto à sobrevivência e desenvolvimento de sintomas de LLC por pelo menos 70 dias adicionais.

F: Detecção de células LLC em sangue total de animais e pacientes. (Objetivos específicos 1 e 2) O objetivo destes experimentos é avaliar o potencial de conjugados peptídeo-corante específicos para CLL para detectar células CLL em amostras de sangue. Os experimentos de calibração serão realizados em três níveis.

1. Dopagem celular: Amostras criopreservadas de células de pacientes CLL serão adicionadas ao meio de cultura RPMI ou sangue humano normal (em três concentrações). As células B isoladas conforme descrito em A acima serão incubadas com o conjugado peptídeo-corante apropriado por 30 minutos a 37OC. As células serão lavadas e analisadas quanto à ligação do peptídeo por citometria de fluxo. Da mesma forma, as células A20 serão adicionadas ao sangue normal do camundongo e testadas com conjugados de peptídeo-corante específicos para A20.
2. Modelo animal: Usando o modelo animal descrito acima, amostras de sangue serão coletadas uma vez por semana durante a fase de indução do tumor. Após a lise das hemácias, as células remanescentes serão incubadas com conjugados peptídeo-corante, lavadas e analisadas por citometria de fluxo. Além disso, as amostras serão coletadas uma vez/quinzenalmente dos animais sobreviventes do Estudo B e analisadas para doença residual mínima e recaída.
3. Acompanhamento do paciente: Serão utilizadas alíquotas de amostras de sangue coletadas durante o acompanhamento de rotina dos pacientes com LLC. As células serão incubadas com o conjugado peptídeo-corante apropriado por 30 minutos a 37OC. As células serão lavadas e analisadas quanto à ligação do peptídeo por citometria de fluxo.

G: Estatística A citotoxicidade de PDCs e droga livre será avaliada calculando a % de inibição do crescimento de células tratadas versus células não tratadas. Os experimentos serão realizados em triplicata e repetidos três vezes. Em estudos com animais, a sobrevivência será avaliada usando curvas de Kaplan-Meier. Estatísticas adicionais relacionadas às análises bioinformáticas são descritas em detalhes acima na seção 1.7-B.