Koniugaty peptydowo-lekowe do spersonalizowanej, celowanej terapii przewlekłej białaczki limfocytowej

Metodologia A: Peptydy swoiste dla PBL: (Cel szczegółowy 1) Pobiera się próbki krwi pełnej od zdrowych ochotników oraz nowo zdiagnozowanych i nieleczonych pacjentów z PBL zgodnie z naszym pozwoleniem helsińskim nr. 0432-13-RMC. (Centrum Medyczne Rabina) Pobieranie próbek w okresie obserwacji i od dodatkowych 80 pacjentów będzie objęte dodatkowymi zgłoszeniami z Helsinek, które są obecnie w toku. Limfocyty rozdziela się stosując Ficoll i komórki B izoluje stosując zestaw do izolacji komórek B. Komórki B od zdrowych ochotników i porcje tych wyizolowanych komórek od każdego pacjenta zamraża się do późniejszego wykorzystania (patrz D: poniżej). Pozostałe komórki pacjenta dzieli się na dwie frakcje. Jeden służy do ekstrakcji RNA. Drugi jest eksponowany na „wchłoniętą” bibliotekę fagową, wstępnie zaabsorbowaną na normalnych komórkach. Po inkubacji komórki przemywa się, a fagi związane z błoną komórkową eluuje się i odzyskuje. Komórki są następnie lizowane, a lizat zatrzymywany. Fagi w eluacie i lizacie (odpowiednio związane z błoną i zinternalizowane) amplifikuje się oddzielnie w E.coli. Amplifikowany fag izoluje się i przygotowuje DNA dla NGS. Sekwencjonowanie przeprowadza się w zewnętrznej placówce podstawowej (The Technion Genome Center).

. B: Analiza bioinformatyczna sekwencji peptydów (Cel szczegółowy 1) I) Sekwencjonowanie peptydów: Odczyty sekwencji uzyskuje się z bibliotek fagowego DNA wygenerowanych i analizowanych za pomocą wysokowydajnego sekwencjonowania (system Illumina HiSeq). Kontrole kontroli jakości przeprowadzane są za pomocą narzędzia FastQC. Odczyty są przetwarzane w celu przycięcia adapterów i usunięcia sekwencji konsensusowych z każdej strony za pomocą oprogramowania Cutadapt (23). Pozostałe znaczniki fragmentów zawierają sekwencję DNA peptydów i oczekuje się, że będą miały długość 21 nukleotydów. Następnie pakiet BioString z platformy Bioconductor jest używany do translacji tych sekwencji nukleotydowych, a liczba wystąpień każdej sekwencji peptydowej jest obliczana w celu znalezienia najczęstszych peptydów. Po normalizacji do rozmiaru biblioteki, porównuje się zliczenia sekwencji peptydów z różnych bibliotek pacjentów, aby znaleźć wspólne sekwencje. Sekwencje z frakcji puli związanej z błoną są odejmowane od frakcji puli zinternalizowanej, tak aby usunąć klony związane z błoną, które mogły nie zostać pomyślnie wymyte z komórki CLL. Sekwencje pozostające w zinternalizowanej puli służą jako kandydaci do terapii koniugatem peptydów. Następnie zostanie zastosowane jednowymiarowe podejście regresji logistycznej do przetestowania możliwych powiązań liczby peptydów z wynikami klinicznymi i genetycznymi. Gdy parametry kliniczne są traktowane jako zmienne ciągłe, zostanie wdrożona regresja liniowa. Kandydaci na peptydy zostaną przeszukani w bazie danych PepBank (24) w celu sprawdzenia, czy wiadomo, że są one związane z rakiem lub innymi chorobami i stanami, takimi jak apoptoza lub angiogeneza. Na koniec opracowany zostanie bioinformatyczny skrypt rurociągu, automatyzujący powyższe etapy analizy bioinformatycznej.

II) RNA-seq do wykrywania wzorców ekspresji genów i genów fuzyjnych:

Głównym celem analizy RNA-seq jest wykrycie specyficznych wzorców ekspresji genów, które można skorelować z sekwencjami peptydowymi i parametrami klinicznymi. Te wzorce ekspresji dostarczą wskazówek dotyczących ekspresji receptorów na powierzchni komórki i aktywności szlaku wewnątrzkomórkowego. Pacjenci zostaną podzieleni na podstawie sekwencji peptydów internalizowanych przez komórki B-CLL i zostanie przeprowadzony test statystyczny w celu wykrycia genów o zróżnicowanej ekspresji. Przeprowadzona zostanie analiza szlaków w celu wywnioskowania zmian funkcjonalnych, które mogą rzucić światło na możliwą rolę receptorów peptydowych w kaskadzie sygnalizacji komórkowej. Oprogramowanie Trim galore będzie używane do przycinania adapterów i usuwania baz niskiej jakości z końców odczytów. Przycięte odczyty zostaną zmapowane do ludzkiego genomu (hg38) przy użyciu oprogramowania TopHat2. Liczba odczytów nakładających się na każdy z adnotowanych genów zostanie zliczona przy użyciu pakietu Pythona HT-seq. DESeq w ramach Bioconductor zostanie wykorzystany do normalizacji i różnicowej analizy ekspresji przy użyciu wariantów dokładnego testu Fishera. Do wykrywania szlaków regulowanych w górę iw dół zostanie zastosowana metoda ogólnego wzbogacania zestawu genów (GAGE). RNA-seq jest również używany do wykrywania zdarzeń genów fuzyjnych w komórkach nowotworowych pacjenta i może być stosowany jako niezależna metoda walidacji do testowania czułości koniugatu peptyd-barwnik stosowanego do monitorowania choroby. W tym celu do identyfikacji transkryptów fuzji zostaną wykorzystane trzy różne narzędzia TopHat-fusion, defuse i ChimeraScan. W celu usunięcia kandydatów o niskiej jakości, jak opisano powyżej, zostanie zastosowanych kilka etapów filtracji, a tylko kandydaci wykryci przez wszystkie trzy narzędzia zostaną wybrani do walidacji RT-PCR.

C: Syntezy peptydów i koniugatów (Cele szczegółowe 1,2,3) Peptydy będą syntetyzowane przy użyciu chemii w fazie stałej. W pierwszym etapie projektu zostaną zsyntetyzowane dwa peptydy specyficzne dla już zidentyfikowanych komórek białaczkowych myszy A20, a mianowicie HIS SER THR PRO SER SER PRO (Peptide 1) oraz ASP SER SER LEU PHE ALA LEU (Peptide 2). Na późniejszych etapach (patrz poniżej) zostaną zsyntetyzowane wybrane peptydy specyficzne dla ludzkiej CLL, gdy ich sekwencje staną się dostępne. Wybrane zostaną tylko peptydy, które będą wielokrotnie powtarzać odczyty (>5) (patrz B powyżej) (maksymalnie 3 na pacjenta), ponieważ reprezentują one klony fagów o większej skłonności do indukowania wychwytu do komórek. Peptydy będą syntetyzowane zarówno jako koniugaty barwników fluorescencyjnych, jak i koniugatów leków w oparciu o naszą poprzednią pracę z ukierunkowanymi koniugatami wielolekowymi (21). Zastosujemy leki o różnych mechanizmach działania, takie jak iperyt azotowy Chlorambucil stosowany w leczeniu starszych pacjentów z CLL oraz inhibitor mikrotubul Combretastatin 4A, o którym wiadomo, że indukuje apoptozę w komórkach CLL (25). Czystość i skład produktów zostaną zweryfikowane za pomocą HPLC i LC/MS. Syntezy będą przeprowadzane przez dostawcę zewnętrznego.

D: Walidacja in vitro specyficzności peptydów i aktywności PDC: (Cele szczegółowe 1, 2, 3) Specyficzność peptydów: Specyficzność peptydów ukierunkowanych zostanie wykazana przez inkubację koniugatów peptyd-barwnik z komórkami docelowymi i kontrolnymi. W przypadku mysiego układu CLL jako komórki docelowe zostaną użyte komórki A20, a jako komórki kontrolne zostaną użyte normalne mysie limfocyty śledziony i pierwotne hodowle mysiej skóry i komórek nabłonkowych. W przypadku ludzkiego układu CLL, komórki CLL pacjenta i normalne ludzkie limfocyty oraz komórki HUVEC zostaną użyte odpowiednio jako komórki docelowe i kontrolne. Komórki będą inkubowane z peptydami znakowanymi FITC zarówno w 4oC, jak i 37oC, przemywane i analizowane odpowiednio pod kątem wiązania i internalizacji. Wiązanie będzie oceniane za pomocą cytometrii przepływowej i internalizacji za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Cytotoksyczność PDC: Komórki docelowe i kontrolne będą inkubowane przez 24 i 48 godzin ze wzrastającymi stężeniami (0-50 uM równoważników leku) wolnego leku lub PDC. Procentowe zahamowanie wzrostu zostanie ocenione za pomocą testu XTT. PDC specyficzne dla cytotoksyczności A20 zostaną następnie ocenione in vivo (patrz E: poniżej).

Systemy hodowli komórkowych: Linię komórkową A20 hoduje się i utrzymuje w pożywce hodowlanej RPMI uzupełnionej FBS. Normalne kultury pierwotne są utrzymywane na pożywkach selektywnych. Z drugiej strony przeżycie ludzkich komórek CLL w hodowli zależy od kilku unikalnych czynników mikrośrodowiskowych, w tym stymulacji antygenem BCR komórek B, pomocy limfocytów T poprzez interakcję CD40-CD40L, stymulacji z komórek zrębowych szpiku kostnego Chemokina CXCL12 i stymulacja receptora Toll-Like 9. Warunki te będą naśladowane in vitro (26) przez dodanie do pożywki hodowlanej anty-IgM (w celu usieciowania BCR), wspólną hodowlę z fibroblastami wykazującymi ekspresję CD40L, dodanie odpowiednio rekombinowanych dinukleotydów CXCL12 i CpG. Warunki te zostaną wykorzystane do przetestowania swoistości i skuteczności ludzkich PDC wobec kriokonserwowanych próbek komórek CLL pacjenta i normalnych ludzkich limfocytów (kontrole).

E: Badania na zwierzętach z wykorzystaniem mysiego modelu CLL A20 (Cel szczegółowy 3) Chociaż stosowano lub testowano kilka koniugatów przeciwciało-lek do leczenia CLL (16), opublikowano niewiele informacji na temat skuteczności PDC w tym choroba. Dlatego naszym celem jest zbadanie zachowania naszych PDC specyficznych dla A20 w zwierzęcym modelu CLL, zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt Ariel University, zezwolenie nr. IL-47-08-13. Aby zweryfikować kalibrację rozwoju CLL, komórki A20 zostaną wstrzyknięte dożylnie myszom Balb/c i monitorowany będzie rozwój objawów CLL. Zwykle trwa to od 40 do 50 dni.

Badanie A): W tym momencie niewiele wiemy o najskuteczniejszym schemacie leczenia PDC. Z tego powodu i w oparciu o opublikowaną literaturę, najpierw przetestujemy ogólnoustrojową tolerancję zwierząt na leki zawarte w PDC, wstrzykując grupom myszy bez nowotworu dootrzewnowo 1, 7,5 lub 15 mg/kg jednego chlorambucylu i kombretastatyny 4A zawierające PDC co trzecie dni przez 3 tygodnie. Zwierzęta będą monitorowane pod kątem chorobowości ogólnoustrojowej i przeżywalności. Na podstawie tych wyników zostanie wybrany wstępny harmonogram leczenia w celu porównania dwóch stężeń dla każdego z dwóch PDC. Zwierzęta wykazujące początkowe objawy CLL będą leczone i obserwowane pod kątem przeżycia i rozwoju objawów CLL przez co najmniej i dodatkowe 70 dni.

Badanie B: Korzystając z wyników Badania A, najskuteczniejszy PDC będzie dalej badany. Farmakokinetyka koniugatu leku zostanie przeanalizowana przez podanie go w 5 stężeniach leku, w tym stosowanego w badaniu A. Próbki krwi zostaną pobrane z żyły ogonowej po 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10 i 24 godzinach. PDC zostanie wyodrębnione i przeanalizowane przez LC/MS pod kątem zawartości i integralności. Stężenia leków będą analizowane metodą HPLC i stosowane do obliczania standardowych parametrów PK [Cmax; TCmax; T1/2]. Na podstawie tych doświadczeń opracowany zostanie dodatkowy protokół leczenia, mający na celu utrzymanie maksymalnego stężenia PDC we krwi przez cały okres leczenia. Protokół zostanie przetestowany na dodatkowej grupie zwierząt. Po okresie leczenia zwierzęta będą obserwowane pod kątem przeżycia i rozwoju objawów CLL przez co najmniej i dodatkowe 70 dni.

F: Wykrywanie komórek CLL w pełnej krwi zwierzęcia i pacjenta. (Cele szczegółowe 1 i 2) Celem tych doświadczeń jest ocena potencjału specyficznych dla PBL koniugatów peptyd-barwnik do wykrywania komórek CLL w próbkach krwi. Eksperymenty kalibracyjne będą prowadzone na trzech poziomach.

1. Domieszkowanie komórek: Kriokonserwowane próbki komórek PBL pacjenta zostaną dodane do pożywki hodowlanej RPMI lub normalnej krwi ludzkiej (w trzech stężeniach). Komórki B wyizolowane w sposób opisany w punkcie A powyżej będą inkubowane z odpowiednim koniugatem peptyd-barwnik przez 30 minut w temperaturze 37°C. Komórki zostaną przemyte i zanalizowane pod kątem wiązania peptydów za pomocą cytometrii przepływowej. Podobnie, komórki A20 zostaną dodane do normalnej krwi myszy i przetestowane z koniugatami peptyd-barwnik swoistymi dla A20.
2. Model zwierzęcy: Stosując opisany powyżej model zwierzęcy, próbki krwi będą pobierane raz w tygodniu podczas fazy indukcji nowotworu. Po lizie RBC pozostałe komórki będą inkubowane z koniugatami peptyd-barwnik, płukane i analizowane metodą cytometrii przepływowej. Ponadto raz/dwa tygodnie będą pobierane próbki od zwierząt, które przeżyły Badanie B i analizowane pod kątem minimalnej choroby resztkowej i nawrotu.
3. Obserwacja pacjenta: Zostaną użyte próbki krwi pobrane podczas rutynowej obserwacji pacjentów z PBL. Komórki będą inkubowane z odpowiednim koniugatem peptyd-barwnik przez 30 minut w temperaturze 37°C. Komórki zostaną przemyte i zanalizowane pod kątem wiązania peptydów za pomocą cytometrii przepływowej.

G: Statystyka Cytotoksyczność PDC i wolnego leku będzie oceniana przez obliczenie % zahamowania wzrostu komórek traktowanych i nietraktowanych. Eksperymenty zostaną przeprowadzone w trzech powtórzeniach i powtórzone trzykrotnie. W badaniach na zwierzętach przeżywalność będzie oceniana przy użyciu krzywych Kaplana-Meiera. Dodatkowe statystyki związane z analizami bioinformatycznymi zostały szczegółowo opisane powyżej w sekcji 1.7-B.