Peptid-Wirkstoff-Konjugate für die personalisierte, zielgerichtete Therapie der chronischen lymphatischen Leukämie

Methode A: CLL-spezifische Peptide: (Spezifisches Ziel 1) Vollblutproben werden von gesunden Freiwilligen und neu diagnostizierten und unbehandelten CLL-Patienten gemäß unserer Helsinki-Genehmigung Nr. 0432-13-RMC. (Rabin Medical Center) Die Beschaffung von Proben bei der Nachsorge und von weiteren 80 Patienten wird durch zusätzliche Helsinki-Einreichungen abgedeckt, die jetzt im Gange sind. Lymphozyten werden unter Verwendung von Ficoll abgetrennt und die B-Zellen unter Verwendung eines B-Zell-Isolierungskits isoliert. Die B-Zellen von den gesunden Freiwilligen und ein Aliquot dieser isolierten Zellen von jedem Patienten werden zur späteren Verwendung eingefroren (siehe D: unten). Die verbleibenden Patientenzellen werden in zwei Fraktionen geteilt. Einer wird für die RNA-Extraktion verwendet. Der andere wird einer "absorbierten" Phagenbibliothek ausgesetzt, die auf normalen Zellen vorabsorbiert wurde. Nach der Inkubation werden die Zellen gewaschen und an die Zellmembran gebundene Phagen werden eluiert und gewonnen. Die Zellen werden dann lysiert und das Lysat zurückbehalten. Phagen im Eluat und Lysat (membrangebunden bzw. internalisiert) werden separat in E.coli amplifiziert. Die amplifizierten Phagen werden isoliert und die DNA für NGS präpariert. Die Sequenzierung wird in einer externen Core Facility (The Technion Genome Center) durchgeführt.

. B: Bioinformatische Analysen von Peptidsequenzen (spezifisches Ziel 1) I) Sequenzierung von Peptiden: Sequenzablesungen werden von Phagen-DNA-Bibliotheken erhalten, die mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (Illumina HiSeq-System) erstellt und analysiert wurden. Qualitätskontrollen werden mit dem FastQC-Tool durchgeführt. Die Reads werden verarbeitet, um Adapter zu trimmen und die Consensus-Sequenzen von beiden Seiten unter Verwendung der Cutadapt-Software (23) zu entfernen. Die verbleibenden Fragment-Tags enthalten die DNA-Sequenz der Peptide und sind voraussichtlich 21 Nukleotide lang. Als nächstes wird das BioString-Paket aus dem Bioconductor-Framework verwendet, um diese Nukleotidsequenzen zu übersetzen, und die Anzahl der Vorkommen jeder Peptidsequenz wird berechnet, um die häufigsten Peptide zu finden. Nach der Normalisierung auf Bibliotheksgröße werden Peptidsequenzzahlen aus verschiedenen Patientenbibliotheken verglichen, um gemeinsame Sequenzen zu finden. Sequenzen aus der membrangebundenen Poolfraktion werden von der internalisierten Poolfraktion subtrahiert, um membrangebundene Klone zu entfernen, die möglicherweise nicht erfolgreich von der CLL-Zelle eluiert wurden. Die im internalisierten Pool verbleibenden Sequenzen dienen als Kandidaten für die Peptid-Konjugat-Therapie. Ein univariater logistischer Regressionsansatz wird dann verwendet, um mögliche Assoziationen von Peptidzahlen mit klinischen und genetischen Befunden zu testen. Wenn klinische Parameter als kontinuierliche Variablen behandelt werden, wird eine lineare Regression implementiert. Kandidatenpeptide werden in der PepBank-Datenbank (24) abgefragt, um zu prüfen, ob bekannt ist, dass sie mit Krebs oder anderen Krankheiten und Zuständen wie Apoptose oder Angiogenese in Verbindung stehen. Schließlich wird ein bioinformatisches Pipeline-Skript entwickelt, das die oben genannten bioinformatischen Analyseschritte automatisiert.

II) RNA-seq zum Nachweis von Genexpressionsmustern und Fusionsgenen:

Das Hauptziel der RNA-seq-Analyse ist der Nachweis spezifischer Genexpressionsmuster, die mit Peptidsequenzen und klinischen Parametern korreliert werden können. Diese Expressionsmuster geben Hinweise auf die Zelloberflächenrezeptorexpression und die Aktivität des intrazellulären Signalwegs. Die Patienten werden basierend auf den von B-CLL-Zellen internalisierten Peptidsequenzen eingeteilt, und es wird ein statistischer Test durchgeführt, um differenziell exprimierte Gene nachzuweisen. Pathway-Analysen werden durchgeführt, um funktionelle Veränderungen abzuleiten, die Aufschluss über die mögliche Rolle der Peptidrezeptoren in der Signalkaskade der Zelle geben könnten. Trim Galore-Software wird zum Trimmen des Adapters und zum Entfernen von Basen niedriger Qualität von den Enden der Reads verwendet. Getrimmte Reads werden mithilfe der TopHat2-Software auf das menschliche Genom (hg38) abgebildet. Die Anzahl der Reads, die jedes der annotierten Gene überlappen, wird mit dem HT-seq-Python-Paket gezählt. DESeq innerhalb des Bioconductor-Frameworks wird zur Normalisierung und differentiellen Expressionsanalyse unter Verwendung von Varianten des exakten Fisher-Tests verwendet. Die General Applicable Gene-set Enrichment (GAGE)-Methode wird angewendet, um hoch- und herunterregulierte Signalwege zu erkennen. RNA-seq wird auch zum Nachweis von Fusionsgenereignissen in den Krebszellen des Patienten verwendet und kann als unabhängige Validierungsmethode verwendet werden, um die Empfindlichkeit des Peptid-Farbstoff-Konjugats zu testen, das für die Krankheitsüberwachung verwendet wird. Zu diesem Zweck werden drei verschiedene Tools TopHat-Fusion, Defuse und ChimeraScan verwendet, um Fusionstranskripte zu identifizieren. Es werden mehrere Filterschritte angewendet, um wie zuvor beschrieben minderwertige Kandidaten zu entfernen, und nur die Kandidaten, die von allen drei Tools erkannt werden, werden für die RT-PCR-Validierung ausgewählt.

C: Synthese von Peptiden und Konjugaten (Förderziele 1,2,3) Peptide werden mittels Festphasenchemie synthetisiert. In der ersten Phase des Projekts werden die beiden bereits identifizierten Peptide HIS SER THR PRO SER SER PRO (Peptid 1) und ASP SER SER LEU PHE ALA LEU (Peptid 2) synthetisiert, die für A20-Leukämiezellen der Maus spezifisch sind. In späteren Stadien (siehe unten) werden ausgewählte menschliche CLL-spezifische Peptide synthetisiert, sobald ihre Sequenzen verfügbar sind. Es werden nur Peptide mit mehreren wiederholten Lesevorgängen (> 5) (siehe B oben) ausgewählt (maximal 3 pro Patient), da diese Phagenklone mit größerer Neigung zur Induktion der Aufnahme in Zellen darstellen. Peptide werden sowohl als fluoreszierende Farbstoff- als auch als Wirkstoffkonjugate synthetisiert, basierend auf unserer früheren Arbeit mit zielgerichteten Multi-Wirkstoff-Konjugaten (21). Wir werden Medikamente mit unterschiedlichen Wirkungsmechanismen einsetzen, wie den Stickstoffloststoff Chlorambucil, der zur Behandlung älterer CLL-Patienten verwendet wird, und den Mikrotubuli-Inhibitor Combretastatin 4A, von dem bekannt ist, dass er Apoptose in CLL-Zellen induziert (25). Reinheit und Zusammensetzung der Produkte werden durch HPLC und LC/MS verifiziert. Synthesen werden von einem externen Anbieter durchgeführt.

D: In-vitro-Validierung der Peptidspezifität und PDC-Aktivität: (Spezifische Ziele 1, 2, 3) Spezifität von Peptiden: Die Spezifität von zielgerichteten Peptiden wird durch Inkubation von Peptid-Farbstoff-Konjugaten mit Ziel- und Kontrollzellen demonstriert. Für das Maus-CLL-System werden A20-Zellen als Zielzellen und normale Maus-Milz-Lymphozyten und Primärkulturen von Maus-Haut und Epithelzellen als Kontrollzellen verwendet. Für das menschliche CLL-System werden Patienten-CLL-Zellen und normale menschliche Lymphozyten und HUVEC-Zellen als Ziel- bzw. Kontrollzellen verwendet. Die Zellen werden mit FITC-markierten Peptiden sowohl bei 4 °C als auch bei 37 °C inkubiert, gewaschen und auf Bindung bzw. Internalisierung analysiert. Die Bindung wird durch Durchflusszytometrie und die Internalisierung durch konfokale Mikroskopie bewertet.

Zytotoxizität von PDCs: Ziel- und Kontrollzellen werden für 24 und 48 Stunden mit steigenden Konzentrationen (0-50 uM Arzneimitteläquivalente) von freiem Arzneimittel oder PDCs inkubiert. Die prozentuale Wachstumshemmung wird durch den XTT-Assay bewertet. Zytotoxische A20-spezifische PDCs werden dann in vivo bewertet (siehe E: unten).

Zellkultursysteme: Die A20-Zelllinie wird in FBS-ergänztem RPMI-Kulturmedium gezüchtet und gehalten. Normale Primärkulturen werden mit selektiven Medien aufrechterhalten. Andererseits hängt das Überleben menschlicher CLL-Zellen in Kultur von mehreren einzigartigen Mikroumgebungsfaktoren ab, einschließlich der Antigenstimulation der B-Zell-BCR, der T-Zellhilfe durch die CD40-CD40L-Interaktion und der Stimulation aus den Stromazellen des Knochenmarks CXCL12-Chemokin und Stimulation des Toll-Like-Rezeptors 9. Diese Bedingungen werden in vitro nachgeahmt (26) durch Zugabe von Anti-IgM zum Kulturmedium (um die BCRs zu vernetzen), Kokultur mit Fibroblasten, die CD40L exprimieren, Zugabe von rekombinantem CXCL12 bzw. CpG-Dinukleotiden. Diese Bedingungen werden verwendet, um die Spezifität und Wirksamkeit menschlicher PDCs gegenüber kryokonservierten Proben von Patienten-CLL-Zellen und normalen menschlichen Lymphozyten (Kontrollen) zu testen.

E: Tierstudien unter Verwendung des A20-Mausmodells von CLL (spezielles Ziel 3) Während mehrere Antikörper-Wirkstoff-Konjugate zur Behandlung von CLL verwendet wurden oder getestet werden (16), gibt es nur wenige veröffentlichte Informationen über die Wirksamkeit von PDCs dafür Krankheit. Daher wollen wir das Verhalten unserer A20-spezifischen PDCs in einem CLL-Tiermodell gemäß den vom Ariel University Institutional Animal Ethics Committee genehmigten Protokollen, Genehmigungs-Nr. IL-47-08-13. Um die Kalibrierung der CLL-Entwicklung zu validieren, werden A20-Zellen intravenös in Balb/c-Mäuse injiziert und die Entwicklung von CLL-Symptomen überwacht. Normalerweise dauert dies zwischen 40-50 Tagen.

Studie A): Zu diesem Zeitpunkt wissen wir wenig über den effektivsten Behandlungsplan mit PDCs. Aus diesem Grund und basierend auf der veröffentlichten Literatur werden wir zunächst die systemische Toleranz der Tiere gegenüber den Arzneimitteln in den PDCs testen, indem wir Gruppen von Mäusen ohne Tumor intraperitoneal 1, 7,5 oder 15 mg/kg eines Chlorambucils und Combretastatins injizieren 4A mit PDC alle 3 Tage für 3 Wochen. Die Tiere werden auf systemische Morbidität und Überleben überwacht. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wird ein anfänglicher Behandlungsplan ausgewählt, um zwei Konzentrationen für jeden der beiden PDCs zu vergleichen. Tiere, die anfängliche Anzeichen von CLL zeigen, werden behandelt und hinsichtlich des Überlebens und der Entwicklung von CLL-Symptomen für mindestens weitere 70 Tage beobachtet.

Studie B: Anhand der Ergebnisse von Studie A wird die effektivste PDC weiter untersucht. Die PK des Arzneimittelkonjugats wird analysiert, indem es in 5 Arzneimittelkonzentrationen verabreicht wird, einschließlich der für Studie A verwendeten. Blutproben werden aus der Schwanzvene um 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10 und 24 Stunden entnommen. PDC wird extrahiert und mittels LC/MS auf Inhalt und Integrität analysiert. Die Wirkstoffkonzentrationen werden durch HPLC analysiert und zur Berechnung von Standard-PK-Parametern [Cmax; TCmax; T1/2]. Basierend auf diesen Experimenten wird ein zusätzliches Behandlungsprotokoll entwickelt, das darauf abzielt, eine maximale Blut-PDC-Konzentration über den Behandlungszeitraum aufrechtzuerhalten. Das Protokoll wird an einer zusätzlichen Tiergruppe getestet. Nach dem Behandlungszeitraum werden die Tiere für mindestens und weitere 70 Tage hinsichtlich des Überlebens und der Entwicklung von CLL-Symptomen beobachtet.

F: Nachweis von CLL-Zellen in Vollblut von Tieren und Patienten. (Spezifische Ziele 1 und 2) Ziel dieser Experimente ist es, das Potenzial von CLL-spezifischen Peptid-Farbstoff-Konjugaten zum Nachweis von CLL-Zellen in Blutproben zu bewerten. Kalibrierungsexperimente werden auf drei Ebenen durchgeführt.

1. Zelldoping: Kryokonservierte Proben von Patienten-CLL-Zellen werden entweder RPMI-Kulturmedium oder normalem menschlichem Blut (in drei Konzentrationen) zugesetzt. B-Zellen, die wie oben unter A beschrieben isoliert wurden, werden mit dem geeigneten Peptid-Farbstoff-Konjugat für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Zellen werden gewaschen und mittels Durchflusszytometrie auf Peptidbindung analysiert. In ähnlicher Weise werden A20-Zellen zu normalem Mausblut gegeben und mit A20-spezifischen Peptid-Farbstoff-Konjugaten getestet.
2. Tiermodell: Unter Verwendung des oben beschriebenen Tiermodells werden während der Tumorinduktionsphase einmal pro Woche Blutproben entnommen. Nach der RBC-Lyse werden die verbleibenden Zellen mit Peptid-Farbstoff-Konjugaten inkubiert, gewaschen und durch Durchflusszytometrie analysiert. Darüber hinaus werden Proben alle zwei Wochen von Tieren entnommen, die Studie B überleben, und auf minimale Resterkrankung und Rückfall analysiert.
3. Nachsorge der Patienten: Aliquots von Blutproben, die während der routinemäßigen Nachsorge der CLL-Patienten entnommen wurden, werden verwendet. Die Zellen werden mit dem entsprechenden Peptid-Farbstoff-Konjugat für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Zellen werden gewaschen und mittels Durchflusszytometrie auf Peptidbindung analysiert.

G: Statistik Die Zytotoxizität von PDCs und freiem Arzneimittel wird durch Berechnung der prozentualen Wachstumshemmung von behandelten gegenüber unbehandelten Zellen bewertet. Die Experimente werden dreifach durchgeführt und dreimal wiederholt. In Tierstudien wird das Überleben anhand von Kaplan-Meier-Kurven bewertet. Zusätzliche Statistiken im Zusammenhang mit den bioinformatischen Analysen sind oben in Abschnitt 1.7-B ausführlich beschrieben.