Peptid-lægemiddel-konjugater til personlig, målrettet terapi af kronisk lymfatisk leukæmi

Metode A: CLL-specifikke peptider: (Specifikt mål 1) Der modtages fuldblodsprøver fra raske frivillige og nydiagnosticerede og ubehandlede CLL-patienter i henhold til vores Helsinki-tilladelse nr. 0432-13-RMC. (Rabin Medical Center) Indsamling af prøver ved opfølgning og fra yderligere 80 patienter vil blive dækket af yderligere Helsinki-indsendelser, der nu er i gang. Lymfocytter adskilles ved hjælp af Ficoll, og B-cellerne isoleres ved hjælp af et B-celleisoleringskit. B-cellerne fra de raske frivillige og en alikvot af disse isolerede celler fra hver patient fryses til senere brug (se D: nedenfor). De resterende patientceller opdeles i to fraktioner. Den ene bruges til RNA-ekstraktion. Den anden eksponeres for et "absorberet" fagbibliotek præ-absorberet på normale celler. Efter inkubation vaskes celler, og fag bundet til cellemembranen elueres og udvindes. Celler lyseres derefter, og lysatet tilbageholdes. Fager i eluatet og lysatet (henholdsvis membranbundet og internaliseret) amplificeres separat i E. coli. Den amplificerede fag isoleres, og DNA fremstilles til NGS. Sekventering udføres i en ekstern kernefacilitet (The Technion Genome Center).

. B: Bioinformatiske analyser af peptidsekvenser (Specifikt mål 1) I) Sekvensering af peptider: Sekvenslæsninger opnås fra fag-DNA-biblioteker genereret og analyseret med high-throughput-sekventering (Illumina HiSeq-system). Kvalitetskontroltjek udføres ved hjælp af FastQC-værktøjet. Aflæsningerne behandles for at trimme adaptere og fjerne konsensussekvenserne fra begge sider ved hjælp af Cutadapt-softwaren (23). De resterende fragmentmærker indeholder peptidernes DNA-sekvens og forventes at være 21 nukleotider lange. Dernæst bruges BioString-pakken fra Bioconductor-strukturen til at oversætte disse nukleotidsekvenser, og antallet af forekomster af hver peptidsekvens beregnes for at finde de hyppigste peptider. Efter normalisering til biblioteksstørrelse sammenlignes peptidsekvenstællinger fra forskellige patientbiblioteker for at finde fælles sekvenser. Sekvenser fra den membranbundne puljefraktion subtraheres fra den internaliserede poolfraktion for at fjerne membranbundne kloner, som muligvis ikke er blevet elueret med succes fra CLL-cellen. Sekvenserne, der er tilbage i den internaliserede pulje, tjener som kandidater til peptid-konjugatterapi. En univariat logistisk regressionstilgang vil derefter blive brugt til at teste mulige associationer af peptidtal med kliniske og genetiske fund. Når kliniske parametre behandles som kontinuerte variable, vil lineær regression blive implementeret. Kandidatpeptider vil blive forespurgt mod PepBank-databasen (24) for at kontrollere, om de vides at være relateret til cancer eller andre sygdomme og tilstande såsom apoptose eller angiogenese. Endelig vil der blive udviklet et bioinformatisk pipeline-script, der automatiserer ovennævnte bioinformatiske analysetrin.

II) RNA-seq til at detektere genekspressionsmønstre og fusionsgener:

Hovedformålet med RNA-seq-analysen er at påvise specifikke genekspressionsmønstre, som kan korreleres med peptidsekvenser og kliniske parametre. Disse ekspressionsmønstre vil give spor til celleoverfladereceptorekspression og intracellulær pathway-aktivitet. Patienterne vil blive opdelt baseret på peptidsekvenserne internaliseret af B-CLL-celler, og en statistisk test vil blive udført for at påvise differentielt udtrykte gener. Pathway-analyse vil blive udført for at udlede funktionelle ændringer, som kan skygge et lys over peptidreceptorernes mulige rolle i cellesignaleringskaskaden. Trim massevis software vil blive brugt til adapter trimning, og til at fjerne lav kvalitet baser fra enderne af læsninger. Trimmede læsninger vil blive kortlagt til det menneskelige genom (hg38) ved hjælp af TopHat2-software. Antallet af læsninger, der overlapper hvert af de annoterede gener, vil blive talt ved hjælp af HT-seq python-pakken. DESeq inden for Bioconductor rammen vil blive brugt til normalisering og differentiel ekspressionsanalyse ved brug af varianter af Fishers eksakte test. Den generelt anvendelige gen-sæt berigelse (GAGE) metoden vil blive anvendt til at detektere op- og nedregulerede veje. RNA-seq bruges også til at detektere fusionsgenhændelser i patientens cancerceller og kan bruges som en uafhængig valideringsmetode til at teste følsomheden af ​​det peptid-farvestof-konjugat, der anvendes til sygdomsovervågning. Til dette formål vil tre forskellige værktøjer TopHat-fusion, defuse og ChimeraScan blive brugt til at identificere fusionstransskriptioner. Adskillige filtreringstrin vil blive anvendt for at fjerne kandidater af lav kvalitet som beskrevet før, og kun de kandidater, der er detekteret af alle de tre værktøjer, vil blive valgt til RT-PCR-validering.

C: Synteser af peptider og konjugater (Specifikke mål 1,2,3) Peptider vil blive syntetiseret ved hjælp af fast-fase kemi. I projektets første fase syntetiseres de to allerede identificerede peptider specifikke for A20 muse-leukæmiske celler, nemlig HIS SER THR PRO SER SER PRO (Peptid 1) og ASP SER SER LEU PHE ALA LEU (Peptid 2). I senere stadier (se nedenfor) vil udvalgte humane CLL-specifikke peptider blive syntetiseret, efterhånden som deres sekvenser bliver tilgængelige. Kun peptider vil flere gentagelseslæsninger (>5) (se B ovenfor) blive udvalgt (maksimalt 3 pr. patient), da disse repræsenterer fagkloner med større tilbøjelighed til at inducere optagelse i celler. Peptider vil blive syntetiseret både som fluorescerende farvestof- og lægemiddelkonjugater baseret på vores tidligere arbejde med målrettede multilægemiddelkonjugater (21). Vi vil anvende lægemidler med forskellige virkningsmekanismer, såsom nitrogensennep Chlorambucil, der bruges til at behandle ældre CLL-patienter, og mikrotubuli-hæmmeren Combretastatin 4A, kendt for at inducere apoptose i CLL-celler (25). Produkternes renhed og sammensætning vil blive verificeret ved HPLC og LC/MS. Synteser vil blive udført af en ekstern leverandør.

D: In vitro-validering af peptidspecificitet og PDC-aktivitet: (Specifikke mål 1, 2, 3) Specificitet af peptider: Specificiteten af ​​målrettede peptider vil blive demonstreret ved at inkubere peptid-farvestof-konjugater med mål- og kontrolceller. Til muse-CLL-systemet vil A20-celler blive brugt som målceller, og normale musemiltlymfocytter og primære kulturer af musehud og -epitelceller vil blive brugt som kontrolceller. Til det humane CLL-system vil patient-CLL-celler og normale humane lymfocytter og HUVEC-celler blive brugt som henholdsvis mål- og kontrolceller. Celler vil blive inkuberet med FITC-mærkede peptider ved både 4oC og 37oC, vasket og analyseret for henholdsvis binding og internalisering. Binding vil blive evalueret ved flowcytometri og internalisering ved konfokal mikroskopi.

Cytotoksicitet af PDC'er: Mål- og kontrolceller vil blive inkuberet i 24 og 48 timer med stigende koncentrationer (0-50 uM lægemiddelækvivalenter) af frit lægemiddel eller PDC'er. Procent væksthæmning vil blive vurderet ved XTT-assayet. Cytotoksiske A20-specifikke PDC'er vil derefter blive evalueret in vivo (se E: nedenfor).

Cellekultursystemer: A20-cellelinjen dyrkes og vedligeholdes i FBS-suppleret RPMI-kulturmedium. Normale primære kulturer opretholdes med selektive medier. På den anden side er overlevelsen af ​​humane CLL-celler i kultur afhængig af flere unikke mikromiljøfaktorer, herunder antigenstimulering af B-celle BCR, T-cellehjælp gennem CD40-CD40L-interaktionen, stimulering fra knoglemarvsstromalcelle-afledt CXCL12 kemokin og stimulering af toll-lignende receptor 9. Disse betingelser vil blive efterlignet in vitro (26) ved tilsætning til dyrkningsmediet af anti-IgM (for at tværbinde BCR'erne), co-dyrkning med fibroblaster, der udtrykker CD40L, tilsætning af henholdsvis rekombinante CXCL12- og CpG-dinukleotider. Disse betingelser vil blive brugt til at teste specificiteten og effektiviteten af ​​humane PDC'er mod kryokonserverede prøver af patient-CLL-celler og normale humane lymfocytter (kontroller).

E: Dyreforsøg med A20 musemodel af CLL (specifikt mål 3) Mens adskillige antistof-lægemiddelkonjugater til behandling af CLL er blevet brugt eller er ved at blive testet (16), er der kun få offentliggjorte oplysninger om effektiviteten af ​​PDC'er til dette sygdom. Derfor sigter vi mod at studere adfærden af ​​vores A20-specifikke PDC'er i en dyremodel af CLL i henhold til protokoller godkendt af Ariel University Institutional Animal Ethics Committee, tilladelse nr. IL-47-08-13. For at validere kalibreringen af ​​CLL-udvikling vil A20-celler blive injiceret intravenøst ​​i Balb/c-mus, og udviklingen af ​​CLL-symptomer overvåges. Normalt tager dette mellem 40-50 dage.

Undersøgelse A): På dette tidspunkt ved vi lidt om den mest effektive behandlingsplan med PDC'er. Af denne grund, og baseret på publiceret litteratur, vil vi først teste dyrenes systemiske tolerance over for lægemidlerne i PDC'erne ved at injicere grupper af ikke-tumorbærende mus intraperitonealt med 1, 7,5 eller 15 mg/kg af en Chlorambucil og Combretastatin 4A indeholdende PDC hver tredje dag i 3 uger. Dyrene vil blive overvåget for systemisk morbiditet og overlevelse. På baggrund af disse resultater vil der blive udvalgt en indledende behandlingsplan for at sammenligne to koncentrationer for hver af de to PDC'er. Dyr, der viser indledende tegn på CLL, vil blive behandlet og fulgt for overlevelse og udvikling af CLL-symptomer i mindst og yderligere 70 dage.

Undersøgelse B: Ved at bruge resultaterne fra undersøgelse A vil den mest effektive PDC blive undersøgt yderligere. Lægemiddelkonjugatets PK vil blive analyseret ved at administrere det i 5 lægemiddelkoncentrationer, inklusive den, der blev brugt til undersøgelse A. Blodprøver vil blive udtaget fra halevenen efter 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10 og 24 timer. PDC vil blive udtrukket og analyseret af LC/MS for indhold og integritet. Lægemiddelkoncentrationer vil blive analyseret ved HPLC og brugt til at beregne standard PK-parametre [Cmax; TCmax; T1/2]. Baseret på disse eksperimenter vil der blive udtænkt en yderligere behandlingsprotokol, der har til formål at opretholde en maksimal PDC-koncentration i blodet over behandlingsperioden. Protokollen vil blive testet på en ekstra gruppe dyr. Efter behandlingsperioden vil dyrene blive fulgt for overlevelse og udvikling af CLL-symptomer i mindst og yderligere 70 dage.

F: Påvisning af CLL-celler i fuldblod fra dyr og patienter. (Specifikke mål 1 og 2) Formålet med disse eksperimenter er at vurdere potentialet af CLL-specifikke peptid-farvestof-konjugater til at påvise CLL-celler i blodprøver. Kalibreringsforsøg vil blive udført på tre niveauer.

1. Celledoping: Kryokonserverede prøver af patientens CLL-celler vil blive tilsat til enten RPMI-dyrkningsmedium eller normalt humant blod (i tre koncentrationer). B-celler isoleret som beskrevet i A ovenfor vil blive inkuberet med det passende peptid-farvestof-konjugat i 30 minutter ved 37°C. Celler vil blive vasket og analyseret for peptidbinding ved flowcytometri. Tilsvarende vil A20-celler blive tilføjet til normalt museblod og testet med A20-specifikke peptid-farvestof-konjugater.
2. Dyremodel: Ved at bruge dyremodellen beskrevet ovenfor, vil der blive taget blodprøver en gang om ugen under tumorinduktionsfasen. Efter RBC-lyse vil de resterende celler blive inkuberet med peptid-farvestof-konjugater, vasket og analyseret ved flowcytometri. Ydermere vil der blive udtaget prøver en gang i fjorten dage fra dyr, der overlever undersøgelse B og analyseret for minimal restsygdom og tilbagefald.
3. Patientopfølgning: Alikvoter af blodprøver taget under rutinemæssig opfølgning af CLL-patienter vil blive brugt. Celler vil blive inkuberet med det passende peptid-farvestof-konjugat i 30 minutter ved 37°C. Celler vil blive vasket og analyseret for peptidbinding ved flowcytometri.

G: Statistik Cytotoksicitet af PDC'er og frit lægemiddel vil blive vurderet ved at beregne % væksthæmning af behandlede versus ubehandlede celler. Eksperimenter vil blive udført i tre eksemplarer og gentaget tre gange. I dyreforsøg vil overlevelse blive vurderet ved hjælp af Kaplan-Meier-kurver. Yderligere statistik relateret til de bioinformatiske analyser er beskrevet i detaljer ovenfor i afsnit 1.7-B.