Conjugados de péptido y fármaco para una terapia dirigida y personalizada de la leucemia linfocítica crónica

Metodología A: Péptidos específicos de CLL: (Objetivo específico 1) Se reciben muestras de sangre completa de voluntarios sanos y de pacientes con CLL recién diagnosticados y no tratados de acuerdo con nuestro permiso de Helsinki n. 0432-13-RMC. (Centro Médico Rabin) La adquisición de muestras en el seguimiento y de 80 pacientes adicionales estará cubierta por presentaciones adicionales de Helsinki que ya están en curso. Los linfocitos se separan usando Ficoll y las células B se aíslan usando un kit de aislamiento de células B. Las células B de los voluntarios sanos y una alícuota de esas células aisladas de cada paciente se congelan para su uso posterior (ver D: a continuación). Las células restantes del paciente se dividen en dos fracciones. Uno se utiliza para la extracción de ARN. El otro se expone a una biblioteca de fagos "Absorbida" preabsorbida en células normales. Después de la incubación, las células se lavan y los fagos unidos a la membrana celular se eluyen y recuperan. Luego se lisan las células y se retiene el lisado. Los fagos en el eluato y lisado (unidos a la membrana e internalizados respectivamente) se amplifican por separado en E.coli. Los fagos amplificados se aíslan y el ADN se prepara para NGS. La secuenciación se lleva a cabo en una instalación central externa (The Technion Genome Center).

. B: Análisis bioinformáticos de secuencias peptídicas (objetivo específico 1) I) Secuenciación de péptidos: las lecturas de secuencias se obtienen a partir de bibliotecas de ADN de fagos generadas y analizadas con secuenciación de alto rendimiento (sistema Illumina HiSeq). Los controles de calidad se realizan con la herramienta FastQC. Las lecturas se procesan para recortar los adaptadores y eliminar las secuencias de consenso de cualquier lado utilizando el software Cutadapt (23). Las etiquetas de fragmentos restantes contienen la secuencia de ADN de los péptidos y se espera que tengan una longitud de 21 nucleótidos. A continuación, se utiliza el paquete BioString del marco Bioconductor para traducir estas secuencias de nucleótidos y se calcula el número de apariciones de cada secuencia peptídica para encontrar los péptidos más frecuentes. Después de la normalización al tamaño de la biblioteca, se comparan los recuentos de secuencias de péptidos de diferentes bibliotecas de pacientes para encontrar secuencias comunes. Las secuencias de la fracción combinada unida a la membrana se sustraen de la fracción combinada internalizada para eliminar los clones unidos a la membrana que pueden no haberse eluido satisfactoriamente de la célula CLL. Las secuencias que quedan en el conjunto internalizado sirven como candidatas para la terapia con conjugados peptídicos. A continuación, se utilizará un enfoque de regresión logística univariable para probar posibles asociaciones de recuentos de péptidos con hallazgos clínicos y genéticos. Cuando los parámetros clínicos se traten como variables continuas, se implementará la regresión lineal. Los péptidos candidatos se consultarán en la base de datos de PepBank (24) para verificar si se sabe que están relacionados con el cáncer u otras enfermedades y afecciones, como la apoptosis o la angiogénesis. Finalmente, se desarrollará un script de tubería bioinformática que automatice los pasos de análisis bioinformático anteriores.

II) RNA-seq para detectar patrones de expresión génica y genes de fusión:

El objetivo principal del análisis RNA-seq es detectar patrones de expresión génica específicos que puedan correlacionarse con secuencias peptídicas y parámetros clínicos. Estos patrones de expresión darán pistas sobre la expresión del receptor de la superficie celular y la actividad de la vía intracelular. Los pacientes se dividirán en función de las secuencias peptídicas internalizadas por las células B-CLL y se realizará una prueba estadística para detectar genes expresados ​​diferencialmente. Se realizará un análisis de vías para inferir cambios funcionales que puedan arrojar luz sobre el posible papel de los receptores peptídicos en la cascada de señalización celular. Se usará el software Trim galore para recortar adaptadores y para eliminar bases de baja calidad de los extremos de las lecturas. Las lecturas recortadas se asignarán al genoma humano (hg38) utilizando el software TopHat2. El número de lecturas que superponen cada uno de los genes anotados se contará utilizando el paquete python HT-seq. DESeq dentro del marco Bioconductor se utilizará para la normalización y el análisis de expresión diferencial utilizando variantes de la prueba exacta de Fisher. El método de enriquecimiento de conjunto de genes generalmente aplicable (GAGE) se aplicará para detectar vías reguladas hacia arriba y hacia abajo. RNA-seq también se usa para detectar eventos de genes de fusión en las células cancerosas del paciente y se puede usar como un método de validación independiente para probar la sensibilidad del conjugado de péptido-colorante usado para monitorear la enfermedad. Para ello, se utilizarán tres herramientas diferentes, TopHat-fusion, defuse y ChimeraScan, para identificar transcripciones de fusión. Se aplicarán varios pasos de filtración para eliminar los candidatos de baja calidad como se describió anteriormente, y solo aquellos candidatos detectados por las tres herramientas se elegirán para la validación de RT-PCR.

C: Síntesis de Péptidos y conjugados (Objetivos específicos 1,2,3) Los péptidos se sintetizarán mediante química en fase sólida. En la primera etapa del proyecto se sintetizarán los dos péptidos específicos para células leucémicas de ratón A20 ya identificados, a saber, HIS SER THR PRO SER SER PRO (Péptido 1) y ASP SER SER LEU PHE ALA LEU (Péptido 2). En etapas posteriores (ver a continuación), se sintetizarán péptidos específicos de CLL humanos seleccionados a medida que sus secuencias estén disponibles. Solo se seleccionarán los péptidos con múltiples lecturas repetidas (>5) (ver B arriba) (máximo de 3 por paciente) ya que estos representan clones de fagos con mayor propensión a inducir la absorción en las células. Los péptidos se sintetizarán como colorantes fluorescentes y como conjugados de fármacos en función de nuestro trabajo anterior con conjugados de múltiples fármacos específicos (21). Emplearemos fármacos con diferentes mecanismos de acción, como la mostaza nitrogenada Clorambucilo que se utiliza para tratar pacientes de edad avanzada con LLC, y el inhibidor de microtúbulos Combretastatin 4A, conocido por inducir la apoptosis en las células de LLC (25). La pureza y composición de los productos se verificará mediante HPLC y LC/MS. Las síntesis serán realizadas por un proveedor externo.

D: Validación in vitro de la especificidad del péptido y la actividad de PDC: (Objetivos específicos 1, 2, 3) Especificidad de los péptidos: La especificidad de los péptidos dirigidos se demostrará incubando conjugados de péptido-colorante con células diana y de control. Para el sistema CLL de ratón, se utilizarán células A20 como células diana y linfocitos esplénicos de ratón normales y cultivos primarios de piel de ratón y células epiteliales se utilizarán como células de control. Para el sistema CLL humano, las células CLL del paciente y los linfocitos humanos normales y las células HUVEC se utilizarán como células objetivo y de control, respectivamente. Las células se incubarán con péptidos marcados con FITC a 4oC y 37oC, se lavarán y analizarán para unión e internalización respectivamente. La unión se evaluará mediante citometría de flujo y la internalización mediante microscopía confocal.

Citotoxicidad de los PDC: las células diana y de control se incubarán durante 24 y 48 horas con concentraciones crecientes (0-50 uM de equivalentes de fármaco) de fármaco libre o PDC. El porcentaje de inhibición del crecimiento se evaluará mediante el ensayo XTT. A continuación, se evaluarán in vivo los PDC específicos de A20 citotóxicos (véase E: a continuación).

Sistemas de cultivo celular: La línea celular A20 se cultiva y mantiene en medio de cultivo RPMI complementado con FBS. Los cultivos primarios normales se mantienen con medios selectivos. Por otro lado, la supervivencia de las células CLL humanas en cultivo depende de varios factores microambientales únicos, que incluyen la estimulación antigénica del BCR de células B, la ayuda de las células T a través de la interacción CD40-CD40L, la estimulación de células derivadas del estroma de la médula ósea Quimiocina CXCL12 y estimulación del receptor Toll-Like 9. Estas condiciones se imitarán in vitro (26) mediante la adición al medio de cultivo de anti-IgM (para entrecruzar los BCR), el cultivo conjunto con fibroblastos que expresan CD40L, la adición de dinucleótidos CXCL12 y CpG recombinantes, respectivamente. Estas condiciones se utilizarán para probar la especificidad y la eficacia de las PDC humanas frente a muestras crioconservadas de células de LLC de pacientes y linfocitos humanos normales (controles).

E: Estudios en animales que utilizan el modelo de ratón A20 de CLL (Objetivo específico 3) Si bien se han utilizado o se están probando varios conjugados de anticuerpo y fármaco para el tratamiento de la CLL (16), hay poca información publicada sobre la eficacia de los PDC para este tratamiento. enfermedad. Por lo tanto, nuestro objetivo es estudiar el comportamiento de nuestros PDC específicos A20 en un modelo animal de LLC, de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Ética Animal Institucional de la Universidad Ariel, permiso no. IL-47-08-13. Para validar la calibración del desarrollo de CLL, se inyectarán células A20 por vía intravenosa en ratones Balb/c y se controlará el desarrollo de los síntomas de CLL. Por lo general, esto toma entre 40 y 50 días.

Estudio A): En este punto, sabemos poco sobre el programa de tratamiento más eficaz con PDC. Por este motivo, y basándonos en la literatura publicada, probaremos primero la tolerancia sistémica de los animales a los fármacos de los PDC inyectando a grupos de ratones sin tumor por vía intraperitoneal 1, 7,5 o 15 mg/Kg de Clorambucilo y Combretastatina. 4A que contiene PDC cada tercer día durante 3 semanas. Los animales serán monitoreados por morbilidad sistémica y supervivencia. Sobre la base de estos resultados, se seleccionará un programa de tratamiento inicial para comparar dos concentraciones para cada uno de los dos PDC. Los animales que muestren signos iniciales de CLL serán tratados y seguidos para la supervivencia y el desarrollo de síntomas de CLL durante al menos 70 días adicionales.

Estudio B: Usando los resultados del Estudio A, se estudiará más a fondo el PDC más eficaz. La farmacocinética del conjugado de fármaco se analizará administrándolo en 5 concentraciones de fármaco, incluida la utilizada para el Estudio A. Se extraerán muestras de sangre de la vena de la cola a las 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10 y 24 horas. El PDC se extraerá y analizará mediante LC/MS en cuanto a contenido e integridad. Las concentraciones de fármaco se analizarán mediante HPLC y se utilizarán para calcular los parámetros farmacocinéticos estándar [Cmax; TCmáx; T1/2]. Sobre la base de estos experimentos, se diseñará un protocolo de tratamiento adicional destinado a mantener una concentración máxima de PDC en sangre durante el período de tratamiento. El protocolo se probará en un grupo adicional de animales. Después del período de tratamiento, se hará un seguimiento de los animales para determinar la supervivencia y el desarrollo de síntomas de CLL durante al menos 70 días adicionales.

F: Detección de células CLL en sangre completa de animales y pacientes. (Objetivos específicos 1 y 2) El objetivo de estos experimentos es evaluar el potencial de los conjugados de péptido-colorante específicos de LLC para detectar células de LLC en muestras de sangre. Los experimentos de calibración se llevarán a cabo en tres niveles.

1. Dopaje de células: las muestras crioconservadas de células de CLL de pacientes se agregarán al medio de cultivo RPMI o a la sangre humana normal (en tres concentraciones). Las células B aisladas como se describe en A anterior se incubarán con el conjugado de péptido-colorante apropiado durante 30 minutos a 37 °C. Las células se lavarán y analizarán para la unión de péptidos mediante citometría de flujo. De manera similar, se agregarán células A20 a sangre de ratón normal y se analizarán con conjugados de péptido-colorante específicos de A20.
2. Modelo animal: Utilizando el modelo animal descrito anteriormente, se tomarán muestras de sangre una vez por semana durante la fase de inducción del tumor. Después de la lisis de los glóbulos rojos, las células restantes se incubarán con conjugados de péptido-colorante, se lavarán y analizarán mediante citometría de flujo. Además, se tomarán muestras una vez cada quince días de los animales que sobrevivan al Estudio B y se analizarán para la enfermedad residual mínima y la recaída.
3. Seguimiento del paciente: Se utilizarán alícuotas de muestras de sangre tomadas durante el seguimiento de rutina de los pacientes con LLC. Las células se incubarán con el conjugado de péptido-colorante apropiado durante 30 minutos a 37 °C. Las células se lavarán y analizarán para la unión de péptidos mediante citometría de flujo.

G: Estadísticas La citotoxicidad de los PDC y el fármaco libre se evaluará calculando el % de inhibición del crecimiento de las células tratadas frente a las no tratadas. Los experimentos se realizarán por triplicado y se repetirán tres veces. En estudios con animales, la supervivencia se evaluará mediante curvas de Kaplan-Meier. Las estadísticas adicionales relacionadas con los análisis bioinformáticos se describen en detalle anteriormente en la sección 1.7-B.