Coniugati di farmaci peptidici per una terapia personalizzata e mirata della leucemia linfocitica cronica

Metodologia A: Peptidi specifici per LLC: (Obiettivo specifico 1) I campioni di sangue intero vengono ricevuti da volontari sani e da pazienti affetti da LLC di nuova diagnosi e non trattati secondo il nostro permesso di Helsinki n. 0432-13-RMC. (Rabin Medical Center) L'acquisizione di campioni al follow-up e da altri 80 pazienti sarà coperta da ulteriori richieste di Helsinki attualmente in corso. I linfociti vengono separati utilizzando Ficoll e le cellule B isolate utilizzando un kit di isolamento delle cellule B. Le cellule B dei volontari sani e un'aliquota di quelle cellule isolate da ciascun paziente vengono congelate per un uso successivo (vedi D: sotto). Le restanti cellule del paziente sono divise in due frazioni. Uno è utilizzato per l'estrazione dell'RNA. L'altro è esposto a una libreria fagica "Absorbed" pre-assorbita su cellule normali. Dopo l'incubazione, le cellule vengono lavate e i fagi legati alla membrana cellulare vengono eluiti e recuperati. Le cellule vengono quindi lisate e il lisato trattenuto. I fagi nell'eluato e nel lisato (rispettivamente legati alla membrana e interiorizzati) sono amplificati separatamente in E.coli. Il fago amplificato viene isolato e il DNA preparato per NGS. Il sequenziamento viene eseguito in una struttura centrale esterna (The Technion Genome Center).

. B: Analisi bioinformatica di sequenze peptidiche (Obiettivo specifico 1) I) Sequenziamento di peptidi: Le letture di sequenze sono ottenute da librerie di DNA fagico generate e analizzate con sequenziamento ad alto rendimento (sistema Illumina HiSeq). I controlli di controllo della qualità vengono eseguiti utilizzando lo strumento FastQC. Le letture vengono elaborate per tagliare gli adattatori e rimuovere le sequenze di consenso da entrambi i lati utilizzando il software Cutadapt (23). Le rimanenti etichette dei frammenti contengono la sequenza del DNA dei peptidi e dovrebbero avere una lunghezza di 21 nucleotidi. Successivamente, il pacchetto BioString del framework Bioconductor viene utilizzato per tradurre queste sequenze nucleotidiche e viene calcolato il numero di occorrenze di ciascuna sequenza peptidica per trovare i peptidi più frequenti. Dopo la normalizzazione alla dimensione della libreria, i conteggi delle sequenze peptidiche di diverse librerie di pazienti vengono confrontati per trovare sequenze comuni. Le sequenze dalla frazione del pool legato alla membrana vengono sottratte dalla frazione del pool internalizzato in modo da rimuovere i cloni legati alla membrana che potrebbero non essere stati eluiti con successo dalla cellula CLL. Le sequenze rimanenti nel pool interiorizzato fungono da candidati per la terapia con coniugato peptidico. Verrà quindi utilizzato un approccio di regressione logistica univariata per testare possibili associazioni di conta peptidica con risultati clinici e genetici. Quando i parametri clinici sono trattati come variabili continue, verrà implementata la regressione lineare. I peptidi candidati verranno interrogati nel database PepBank (24) per verificare se sono noti per essere correlati al cancro o ad altre malattie e condizioni come l'apoptosi o l'angiogenesi. Infine, verrà sviluppato uno script di pipeline bioinformatica automatizzando le suddette fasi di analisi bioinformatica.

II) RNA-seq per rilevare modelli di espressione genica e geni di fusione:

Lo scopo principale dell'analisi RNA-seq è quello di rilevare specifici modelli di espressione genica che possono essere correlati con sequenze peptidiche e parametri clinici. Questi modelli di espressione forniranno indizi sull'espressione del recettore della superficie cellulare e sull'attività del pathway intracellulare. I pazienti saranno divisi in base alle sequenze peptidiche internalizzate dalle cellule B-CLL e verrà eseguito un test statistico per rilevare i geni differenzialmente espressi. L'analisi del percorso sarà effettuata per inferire cambiamenti funzionali che possano far luce sul possibile ruolo dei recettori peptidici nella cascata del segnale cellulare. Il software Trim a bizzeffe verrà utilizzato per il taglio dell'adattatore e per rimuovere le basi di bassa qualità dalle estremità delle letture. Le letture ritagliate saranno mappate al genoma umano (hg38) utilizzando il software TopHat2. Il numero di letture che si sovrappongono a ciascuno dei geni annotati verrà conteggiato utilizzando il pacchetto python HT-seq. DESeq all'interno del framework Bioconductor sarà utilizzato per la normalizzazione e l'analisi dell'espressione differenziale utilizzando varianti del test esatto di Fisher. Il metodo GAGE ​​(Generally Applicable Gene-set Enrichment) verrà applicato per rilevare i percorsi regolati verso l'alto e verso il basso. L'RNA-seq viene utilizzato anche per rilevare eventi genici di fusione nelle cellule tumorali del paziente e può essere utilizzato come metodo di convalida indipendente per testare la sensibilità del coniugato peptide-colorante utilizzato per il monitoraggio della malattia. A tale scopo, verranno utilizzati tre diversi strumenti TopHat-fusion, defuse e ChimeraScan per identificare i trascritti di fusione. Verranno applicati diversi passaggi di filtrazione per rimuovere i candidati di bassa qualità come descritto in precedenza, e solo i candidati rilevati da tutti e tre gli strumenti saranno scelti per la validazione RT-PCR.

C: Sintesi di peptidi e coniugati (Obiettivi specifici 1,2,3) I peptidi saranno sintetizzati utilizzando la chimica in fase solida. Nella prima fase del progetto verranno sintetizzati i due peptidi specifici per le cellule leucemiche di topo A20 già identificati, ovvero HIS SER THR PRO SER SER PRO (Peptide 1) e ASP SER SER LEU PHE ALA LEU (Peptide 2). Nelle fasi successive (vedi sotto), verranno sintetizzati specifici peptidi specifici per la LLC umana non appena le loro sequenze saranno disponibili. Saranno selezionati solo i peptidi con letture ripetute multiple (>5) (vedi B sopra) (massimo 3 per paziente) in quanto rappresentano cloni fagici con maggiore propensione a indurre l'assorbimento nelle cellule. I peptidi saranno sintetizzati sia come coloranti fluorescenti che come coniugati farmacologici sulla base del nostro precedente lavoro con coniugati mirati multi-farmaco (21). Impiegheremo farmaci con differenti meccanismi d'azione, come l'azotato Chlorambucil usato per trattare i pazienti anziani con CLL, e l'inibitore dei microtubuli Combretastatina 4A, noto per indurre l'apoptosi nelle cellule CLL (25). La purezza e la composizione dei prodotti saranno verificate mediante HPLC e LC/MS. Le sintesi saranno effettuate da un fornitore esterno.

D: Convalida in vitro della specificità peptidica e dell'attività PDC: (Obiettivi specifici 1, 2, 3) Specificità dei peptidi: La specificità dei peptidi bersaglio sarà dimostrata incubando coniugati peptide-colorante con cellule bersaglio e di controllo. Per il sistema CLL di topo, le cellule A20 saranno utilizzate come cellule bersaglio e linfociti splenici di topo normali e colture primarie di pelle di topo e cellule epiteliali saranno utilizzate come cellule di controllo. Per il sistema CLL umano, le cellule CLL dei pazienti ei linfociti umani normali e le cellule HUVEC saranno utilizzate rispettivamente come cellule bersaglio e cellule di controllo. Le cellule saranno incubate con peptidi marcati con FITC sia a 4°C che a 37°C, lavate ed analizzate rispettivamente per il legame e l'internalizzazione. Il legame sarà valutato mediante citometria a flusso e l'internalizzazione mediante microscopia confocale.

Citotossicità delle PDC: Le cellule target e di controllo saranno incubate per 24 e 48 ore con concentrazioni crescenti (0-50uM equivalenti di droga) di droga libera o PDC. L'inibizione percentuale della crescita sarà valutata mediante il test XTT. Le PDC citotossiche specifiche per A20 saranno quindi valutate in vivo (vedi E: sotto).

Sistemi di coltura cellulare: la linea cellulare A20 viene coltivata e mantenuta in terreno di coltura RPMI integrato con FBS. Le colture primarie normali vengono mantenute con terreni selettivi. D'altra parte, la sopravvivenza delle cellule CLL umane in coltura dipende da diversi fattori microambientali unici, tra cui la stimolazione dell'antigene del BCR delle cellule B, l'aiuto delle cellule T attraverso l'interazione CD40-CD40L, la stimolazione da parte delle cellule stromali del midollo osseo derivate Chemochina CXCL12 e stimolazione del recettore Toll-Like 9. Queste condizioni saranno mimate in vitro (26) mediante aggiunta al terreno di coltura di anti-IgM (per reticolare le BCR), co-coltura con fibroblasti che esprimono CD40L, aggiunta rispettivamente di CXCL12 ricombinante e dinucleotidi CpG. Queste condizioni saranno utilizzate per testare la specificità e l'efficacia delle PDC umane contro campioni crioconservati di cellule CLL di pazienti e linfociti umani normali (controlli).

E: Studi su animali utilizzando il modello murino A20 di LLC (obiettivo specifico 3) Sebbene siano stati utilizzati o siano in fase di sperimentazione diversi coniugati anticorpo-farmaco per il trattamento della LLC (16), vi sono poche informazioni pubblicate sull'efficacia delle PDC per questo malattia. Pertanto miriamo a studiare il comportamento dei nostri PDC specifici A20 in un modello animale di CLL, secondo protocolli approvati dal Comitato Etico Animale Istituzionale dell'Università di Ariel, permesso n. IL-47-08-13. Per convalidare la calibrazione dello sviluppo della LLC, cellule A20 saranno iniettate per via endovenosa in topi Balb/c e lo sviluppo dei sintomi della LLC sarà monitorato. Di solito questo richiede tra 40-50 giorni.

Studio A): A questo punto, sappiamo poco sul programma di trattamento più efficace con i PDC. Per questo motivo, e sulla base della letteratura pubblicata, testeremo prima la tolleranza sistemica degli animali ai farmaci nelle PDC iniettando gruppi di topi non portatori di tumore per via intraperitoneale con 1, 7,5 o 15 mg/Kg di un clorambucile e combretastatina 4A contenente PDC ogni tre giorni per 3 settimane. Gli animali saranno monitorati per morbilità e sopravvivenza sistemica. Sulla base di questi risultati, verrà selezionato un programma di trattamento iniziale per confrontare due concentrazioni per ciascuna delle due PDC. Gli animali che mostrano segni iniziali di LLC saranno trattati e seguiti per la sopravvivenza e lo sviluppo dei sintomi di LLC per almeno e ulteriori 70 giorni.

Studio B: Utilizzando i risultati dello Studio A, il PDC più efficace sarà studiato ulteriormente. La PK del coniugato del farmaco verrà analizzata somministrandolo in 5 concentrazioni di farmaco, inclusa quella utilizzata per lo Studio A. I campioni di sangue verranno prelevati dalla vena caudale a 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10 e 24 ore. I PDC saranno estratti e analizzati da LC/MS per contenuto e integrità. Le concentrazioni dei farmaci saranno analizzate mediante HPLC e utilizzate per calcolare i parametri farmacocinetici standard [Cmax; TCmax; T1/2]. Sulla base di questi esperimenti, verrà ideato un protocollo di trattamento aggiuntivo volto a mantenere una concentrazione massima di PDC nel sangue durante il periodo di trattamento. Il protocollo sarà testato su un ulteriore gruppo di animali. Dopo il periodo di trattamento, gli animali saranno seguiti per la sopravvivenza e lo sviluppo dei sintomi della CLL per almeno e ulteriori 70 giorni.

F: Rilevamento delle cellule CLL nel sangue intero animale e paziente. (Obiettivi specifici 1 e 2) Lo scopo di questi esperimenti è valutare il potenziale dei coniugati peptide-colorante specifici per LLC per rilevare cellule CLL in campioni di sangue. Gli esperimenti di calibrazione saranno condotti su tre livelli.

1. Doping cellulare: campioni crioconservati di cellule CLL di pazienti verranno aggiunti al terreno di coltura RPMI o al sangue umano normale (in tre concentrazioni). Le cellule B isolate come descritto in A saranno incubate con l'appropriato coniugato peptide-colorante per 30 minuti a 37°C. Le cellule saranno lavate e analizzate per legame peptidico mediante citometria a flusso. Allo stesso modo, le cellule A20 saranno aggiunte al normale sangue di topo e testate con coniugati peptide-colorante specifici per A20.
2. Modello animale: utilizzando il modello animale sopra descritto, verranno prelevati campioni di sangue una volta alla settimana durante la fase di induzione del tumore. Dopo la lisi dei globuli rossi, le cellule rimanenti saranno incubate con coniugati peptide-colorante, lavate e analizzate mediante citometria a flusso. Inoltre, i campioni saranno prelevati una volta ogni quindici giorni dagli animali sopravvissuti allo Studio B e analizzati per malattia minima residua e recidiva.
3. Follow-up del paziente: Verranno utilizzate aliquote di campioni di sangue prelevati durante il follow-up di routine dei pazienti affetti da CLL. Le cellule saranno incubate con l'appropriato coniugato peptide-colorante per 30 minuti a 37°C. Le cellule saranno lavate e analizzate per legame peptidico mediante citometria a flusso.

G: Statistiche La citotossicità delle PDC e del farmaco libero sarà valutata calcolando la % di inibizione della crescita delle cellule trattate rispetto a quelle non trattate. Gli esperimenti saranno eseguiti in triplicato e ripetuti tre volte. Negli studi sugli animali, la sopravvivenza sarà valutata utilizzando le curve di Kaplan-Meier. Ulteriori statistiche relative alle analisi bioinformatiche sono descritte in dettaglio sopra nella sezione 1.7-B.