만성 림프 구성 백혈병의 맞춤형 표적 치료를 위한 펩타이드-약물-접합체

방법론 A: CLL 특이적 펩타이드: (구체적인 목표 1) 헬싱키 허가 번호 2011-10-11-11-10100000000000000000000000000000000000000000000000000000000000에 따라 건강한 자원자들과 새로 진단되고 치료받지 않은 CLL 환자들로부터 전혈 샘플을 받습니다. 0432-13-RMC. (Rabin Medical Center) 후속 조치 및 추가 80명의 환자로부터 샘플을 획득하는 것은 현재 진행 중인 추가 헬싱키 제출에 포함됩니다. 림프구는 Ficoll을 사용하여 분리되고 B 세포는 B 세포 분리 키트를 사용하여 분리됩니다. 건강한 지원자의 B 세포와 각 환자의 분리된 세포 분취량은 나중에 사용하기 위해 동결됩니다(아래 D 참조). 나머지 환자 세포는 두 부분으로 나뉩니다. 하나는 RNA 추출에 사용됩니다. 다른 하나는 정상 세포에 미리 흡수된 "흡수된" 파지 라이브러리에 노출됩니다. 배양 후, 세포를 세척하고 세포막에 결합된 파지를 용출시켜 회수한다. 그런 다음 세포가 용해되고 용해물이 유지됩니다. 용출액 및 용해물(각각 막 결합 및 내재화)의 파지는 E.coli에서 개별적으로 증폭됩니다. 증폭된 파지를 분리하고 NGS용 DNA를 준비합니다. 시퀀싱은 외부 핵심 시설(The Technion Genome Center)에서 수행됩니다.

. B: 펩티드 서열의 생물정보학적 분석(구체적인 목적 1) I) 펩티드의 시퀀싱: 서열 판독은 고처리량 시퀀싱(Illumina HiSeq 시스템)으로 생성되고 분석된 파지 DNA 라이브러리로부터 얻어진다. 품질 관리 검사는 FastQC 도구를 사용하여 수행됩니다. 판독은 어댑터를 다듬고 Cutadapt 소프트웨어(23)를 사용하여 양쪽에서 합의 시퀀스를 제거하기 위해 처리됩니다. 나머지 조각 태그에는 펩타이드의 DNA 서열이 포함되어 있으며 길이가 21개 뉴클레오티드일 것으로 예상됩니다. 다음으로 Bioconductor 프레임워크의 BioString 패키지를 사용하여 이러한 뉴클레오티드 시퀀스를 번역하고 각 펩타이드 시퀀스의 발생 횟수를 계산하여 가장 빈번한 펩타이드를 찾습니다. 라이브러리 크기에 대한 정규화 후, 서로 다른 환자 라이브러리의 펩티드 서열 계수를 비교하여 공통 서열을 찾습니다. CLL 세포에서 성공적으로 용출되지 않았을 수 있는 막 결합 클론을 제거하기 위해 막 결합 풀 분획의 서열을 내재화된 풀 분획에서 뺍니다. 내재화된 풀에 남아 있는 서열은 펩타이드 접합 요법의 후보 역할을 합니다. 그런 다음 단변량 로지스틱 회귀 접근법을 사용하여 펩티드 수와 임상 및 유전적 소견의 가능한 연관성을 테스트합니다. 임상 매개변수가 연속 변수로 취급되면 선형 회귀가 구현됩니다. 후보 펩타이드는 암이나 기타 질병 및 세포사멸이나 혈관신생과 같은 상태와 관련이 있는지 확인하기 위해 PepBank 데이터베이스(24)에 대해 조회됩니다. 마지막으로, 위의 생물정보 분석 단계를 자동화하는 생물정보 파이프라인 스크립트가 개발될 것입니다.

II) 유전자 발현 패턴 및 융합 유전자를 검출하기 위한 RNA-seq:

RNA-seq 분석의 주요 목표는 펩티드 서열 및 임상 매개변수와 상관관계가 있을 수 있는 특정 유전자 발현 패턴을 검출하는 것입니다. 이러한 발현 패턴은 세포 표면 수용체 발현 및 세포내 경로 활성에 대한 단서를 제공할 것입니다. 환자는 B-CLL 세포에 내재화된 펩타이드 서열에 따라 분류되며, 차별적으로 발현되는 유전자를 검출하기 위해 통계적 테스트가 수행됩니다. 경로 분석은 세포 신호 캐스케이드에서 펩티드 수용체의 가능한 역할에 대한 빛을 가리는 기능적 변화를 추론하기 위해 수행될 것입니다. Trim galore 소프트웨어는 어댑터 트리밍 및 읽기 끝에서 낮은 품질의 베이스를 제거하는 데 사용됩니다. 다듬어진 읽기는 TopHat2 소프트웨어를 사용하여 인간 게놈(hg38)에 매핑됩니다. 주석이 달린 각 유전자와 겹치는 읽기 수는 HT-seq 파이썬 패키지를 사용하여 계산됩니다. Bioconductor 프레임워크 내의 DESeq는 Fisher의 정확 테스트의 변형을 사용하여 정규화 및 차등 발현 분석에 사용됩니다. GAGE(Generally Applicable Gene-set Enrichment) 방법을 적용하여 상향 및 하향 조절 경로를 탐지합니다. RNA-seq은 또한 환자의 암세포에서 융합 유전자 이벤트를 감지하는 데 사용되며 질병 모니터링에 사용되는 펩타이드-염료 접합체의 민감도를 테스트하기 위한 독립적인 검증 방법으로 사용될 수 있습니다. 이를 위해 TopHat-fusion, defuse 및 ChimeraScan의 세 가지 도구를 사용하여 융합 전사체를 식별합니다. 앞에서 설명한 대로 품질이 낮은 후보를 제거하기 위해 여러 필터링 단계가 적용되며 세 가지 도구 모두에서 감지된 후보만 RT-PCR 검증을 위해 선택됩니다.

C: 펩티드 및 접합체의 합성(특정 목적 1,2,3) 펩티드는 고상 화학을 사용하여 합성됩니다. 프로젝트의 첫 번째 단계에서는 이미 확인된 A20 마우스 백혈병 세포에 특이적인 두 개의 펩타이드, 즉 HIS SER THR PRO SER SER PRO(펩타이드 1) 및 ASP SER SER LEU PHE ALA LEU(펩타이드 2)가 합성될 것입니다. 나중 단계(아래 참조)에서 선택된 인간 CLL 특이적 펩티드는 서열이 이용 가능해지면 합성될 것입니다. 펩타이드만 다중 반복 판독(>5)(위의 B 참조)이 선택될 것입니다(환자당 최대 3개). 이들은 세포로 흡수를 유도하는 경향이 더 큰 파지 클론을 나타내기 때문입니다. 펩타이드는 표적 다중 약물 접합체(21)에 대한 이전 연구를 기반으로 형광 염료 및 약물 접합체로 합성될 것입니다. 우리는 노인 CLL 환자를 치료하는 데 사용되는 질소 머스타드 Chlorambucil과 CLL 세포에서 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려진 미세소관 억제제 Combretastatin 4A와 같이 작용 메커니즘이 다른 약물을 사용할 것입니다(25). 제품의 순도 및 구성은 HPLC 및 LC/MS로 검증됩니다. 합성은 외부 공급자에 의해 수행됩니다.

D: 펩티드 특이성 및 PDC 활성의 시험관내 검증: (특정 목표 1, 2, 3) 펩티드의 특이성: 표적 펩티드의 특이성은 펩티드-염료 접합체를 표적 및 대조군 세포와 함께 배양함으로써 증명될 것이다. 마우스 CLL 시스템의 경우 A20 세포를 표적 세포로 사용하고 정상 마우스 비장 림프구와 마우스 피부 및 상피 세포의 기본 배양액을 대조군 세포로 사용합니다. 인간 CLL 시스템의 경우 환자 CLL 세포와 정상 인간 림프구 및 HUVEC 세포가 각각 표적 및 대조군 세포로 사용됩니다. 세포는 4oC와 37oC 모두에서 FITC로 표지된 펩타이드와 함께 배양되고 각각 결합 및 내재화에 대해 세척 및 분석됩니다. 결합은 공초점 현미경에 의한 유세포 분석 및 내재화에 의해 평가될 것입니다.

PDC의 세포독성: 표적 및 대조군 세포는 자유 약물 또는 PDC의 농도(0-50uM 약물 등가물)를 증가시키면서 24시간 및 48시간 동안 배양됩니다. 퍼센트 성장 억제는 XTT 검정에 의해 평가될 것이다. 그런 다음 세포독성 A20 특이적 PDC를 생체 내에서 평가합니다(아래 E: 참조).

세포 배양 시스템: A20 세포주는 FBS 보충 RPMI 배양 배지에서 성장 및 유지됩니다. 정상적인 일차 배양은 선택적 배지로 유지됩니다. 한편, 배양에서 인간 CLL 세포의 생존은 B 세포 BCR의 항원 자극, CD40-CD40L 상호 작용을 통한 T 세포 도움, 골수 간질 세포 유래 자극을 포함한 몇 가지 독특한 미세 환경 요인에 따라 달라집니다. Toll-like Receptor 9의 CXCL12 케모카인 및 자극. 이러한 조건은 항-IgM 배양 배지(BCR을 가교하기 위해), CD40L을 발현하는 섬유아세포와의 공동 배양, 각각 재조합 CXCL12 및 CpG 디뉴클레오티드의 첨가에 의해 시험관 내에서 모방될 것입니다(26). 이들 조건은 환자 CLL 세포 및 정상 인간 림프구(대조군)의 동결보존 샘플에 대한 인간 PDC의 특이성 및 효능을 테스트하는 데 사용될 것이다.

E: CLL의 A20 마우스 모델을 사용한 동물 연구(구체적 목표 3) CLL 치료를 위해 여러 항체-약물 접합체가 사용되었거나 테스트 중이지만(16), 이에 대한 PDC의 효능에 대해 공개된 정보는 거의 없습니다. 질병. 따라서 우리는 Ariel University 기관 동물 윤리 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 CLL의 동물 모델에서 A20 특정 PDC의 동작을 연구하는 것을 목표로 합니다. IL-47-08-13. CLL 발달의 보정을 검증하기 위해 A20 세포를 Balb/c 마우스에 정맥 주사하고 CLL 증상의 발달을 모니터링합니다. 보통 40~50일 정도 소요됩니다.

연구 A): 이 시점에서 우리는 PDC를 사용한 가장 효과적인 치료 일정에 대해 거의 알지 못합니다. 이러한 이유로, 그리고 출판된 문헌을 기반으로, 우리는 비종양 보유 마우스 그룹에 1, 7.5 또는 15mg/Kg의 클로람부실 및 콤브레타스타틴을 복강내 주사하여 PDC의 약물에 대한 동물의 전신 내성을 먼저 테스트할 것입니다. 3주 동안 3일마다 PDC를 포함하는 4A. 전신 이환율 및 생존에 대해 동물을 모니터링할 것이다. 이러한 결과를 바탕으로 두 PDC 각각에 대한 두 가지 농도를 비교하기 위해 초기 치료 일정이 선택됩니다. CLL의 초기 징후를 보이는 동물을 치료하고 적어도 추가 70일 동안 CLL 증상의 생존 및 발달을 추적할 것입니다.

연구 B: 연구 A 결과를 사용하여 가장 효과적인 PDC를 추가로 연구합니다. 약물 컨쥬게이트의 PK는 연구 A에 사용된 것을 포함하여 5가지 약물 농도로 투여하여 분석할 것입니다. 혈액 샘플은 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 10 및 24시간에 꼬리 정맥에서 채취합니다. PDC는 콘텐츠 및 무결성에 대해 LC/MS에 의해 추출 및 분석됩니다. 약물 농도는 HPLC로 분석하고 표준 PK 매개변수[Cmax; TCmax; T1/2]. 이러한 실험을 바탕으로 치료 기간 동안 최대 혈중 PDC 농도를 유지하기 위한 추가적인 치료 프로토콜이 고안될 것입니다. 프로토콜은 추가 동물 그룹에서 테스트됩니다. 치료 기간 후, 동물은 적어도 추가 70일 동안 CLL 증상의 생존 및 발달에 대해 추적될 것입니다.

F: 동물 및 환자 전혈에서 CLL 세포의 검출. (특정 목표 1 및 2) 이러한 실험의 목적은 혈액 샘플에서 CLL 세포를 검출하기 위한 CLL 특이적 펩티드-염료 접합체의 가능성을 평가하는 것입니다. 보정 실험은 세 가지 수준에서 수행됩니다.

1. 세포 도핑: 환자 CLL 세포의 동결보존 샘플을 RPMI 배양 배지 또는 정상 인간 혈액(3가지 농도)에 첨가합니다. 상기 A에 기술된 바와 같이 분리된 B-세포는 370℃에서 30분 동안 적절한 펩티드-염료 접합체와 함께 배양될 것이다. 세포를 세척하고 유동 세포측정법에 의해 펩티드 결합에 대해 분석할 것입니다. 유사하게, A20 세포는 정상적인 마우스 혈액에 추가되고 A20 특정 펩타이드-염료 접합체로 테스트됩니다.
2. 동물 모델: 위에서 설명한 동물 모델을 사용하여 종양 유도 단계에서 혈액 샘플을 주당 1회 채취합니다. RBC 용해 후 나머지 세포는 펩타이드-염료 접합체와 함께 배양하고 세척하고 유세포 분석기로 분석합니다. 또한, 샘플은 연구 B에서 살아남은 동물로부터 2주에 1회 채취되어 최소 잔류 질병 및 재발에 대해 분석됩니다.
3. 환자 후속 조치: CLL 환자의 일상적인 후속 조치 중에 채취한 혈액 샘플의 분취량을 사용합니다. 세포는 370℃에서 30분 동안 적절한 펩티드-염료 접합체와 함께 배양됩니다. 세포를 세척하고 유동 세포측정법에 의해 펩티드 결합에 대해 분석할 것입니다.

G: 처리된 세포 대 처리되지 않은 세포의 % 성장 억제를 계산함으로써 PDC 및 유리 약물의 통계적 세포독성을 평가할 것이다. 실험은 3회 수행되고 3회 반복된다. 동물 연구에서 생존은 Kaplan-Meier 곡선을 사용하여 평가됩니다. 생물정보 분석과 관련된 추가 통계는 위의 섹션 1.7-B에 자세히 설명되어 있습니다.