DNAメチル化と周術期疼痛治療 (MEDAPO)

周術期に、外科患者は生理学的プロセスに深刻な変化を経験します。 外科的ストレスに加えて、これらの変動は、外科的処置中および外科的処置後の麻酔および鎮痛に一般的に使用される薬理学的治療によるものです。

オピオイドは、急性周術期疼痛の管理に不可欠な薬物です。 過去数年間、オピオイドによって誘発される痛覚過敏に多くの注意が払われてきました。これは、オピオイドへの急性および慢性暴露後の臨床的に重要な状態を表しています。 μ-オピオイド受容体の遺伝子発現の増加と痛覚過敏の発症は、エピジェネティックなメカニズムに関連している可能性があることが示唆されています。

エピジェネティックな変化には、通常、DNA、ヒストン、および非ヒストンタンパク質で構成されるクロマチン構造の変化が含まれます。 臨床設定における主な変化は、ヒストンタンパク質の N 末端配列の共有結合修飾と DNA メチル化です。 特に、DNA メチル化は、主に CpG 領域に局在するシトシン残基 (5mC) の 5 番目の炭素原子にメチル基を付加することで行われます。

DNA メチル化は、遺伝子サイレンシングのメカニズムと考えられています。 これは、メチル基の転移を触媒する DNA メチルトランスフェラーゼ (DNMT: DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3B、および DNMT3L) と呼ばれる酵素ファミリー全体によって制御される複雑なプロセスです。

特にDNMT 1、3a、3bは、神経因性疼痛モデルの開発中に研究されました。 免疫組織化学分析により、成体ラット (L4-5) の後根神経節において、DNMT3B が、モデルの誘導後 1 週間ですでに観察され、4 週間持続する重要なアップレギュレーションを示したことが観察されました。それどころか、DNMT1 と DNMT3a は中程度の一時的なアップレギュレーションを示しました。 他の研究では、別のパターンの痛み、急性炎症では、DNMT3a と DNMT3B の発現レベルが特に高いことが示されています。

これらすべての発見は、さまざまな痛みのモデルにおけるこれらの酵素の重要な活動を示唆しています。

オピオイド投与は、DNA メチル化の程度の増加に関連しているようです。 2013 年に発表された研究では、Doehring ら。メタドン置換治療を受けている患者のヘロイン中毒者の DNA メチル化の程度を評価しました。 オピオイドで治療された患者は、DNAメチル化、特にμ-オピオイド受容体の全体的な増加を示しています。 DNAメチル化の程度が、研究で分析された被験者によって報告された痛みの強さと相関していることに注目することは興味深い.

文献には、手術前にオピオイド未使用であるアヘン剤による急性治療を受けている手術患者の DNA メチル化の程度に関連するデータは現在存在しません。

この研究の主な目的は、術前のベースラインレベルと比較して、現在の臨床診療に従ってアヘン剤に暴露された大手術を受ける患者の周術期 DNA メチル化 (全血から抽出) の程度を評価することです。 DNAメチル化の程度の増加が起こる可能性のあるタイミング（術前、術中、術後）が評価されます。

二次的な目的は次のとおりです。DNA メチル化の程度と術後の急性疼痛の強度との間の可能な相関関係を観察し、DNA メチル化の程度と術後の悪心および嘔吐の発生率との間の可能な相関関係を観察します。 DNAメチル化とμオピオイド受容体の遺伝子発現、DNAメチル化の程度と主にメチル化プロセスに関与する遺伝子の発現との間の可能な相関関係を観察し、研究に関与したさまざまな患者の術前段階におけるDNAメチル化の程度を比較します.

MEDAPO 試験は、in vitro でヒト組織を使用する単一中心の臨床試験です。 外科患者におけるオピオイドの急性投与後の DNA メチル化の程度の増加に関する文献の知識が不足しているため、この研究は探索的なものになります。 さらに、術中段階でアヘン剤への曝露を避けることはできませんが、オピオイド治療なしで術後の鎮痛を保証することは可能です。メチル化の増加が術中段階ですでに起こっているかどうか、またはそれがアヘン剤による治療にさらされる時間。

これは、さまざまな術後鎮痛技術を比較する将来の試験への無作為化のタイミングをより適切に計画するための有用な情報を提供します。

研究への参加に同意を表明した、全身麻酔下で実施される大手術を受ける連続した20人の患者が登録される。 このサンプルは、現在の臨床診療によると、アヘン剤に基づく麻酔/鎮痛にさらされたオピオイド未使用の患者における DNA メチル化の増加の可能性を観察するのに十分です。

試験の主な目的に関連する記述的分析が行われます。 DNA メチル化の程度と術後の急性疼痛との相関関係を観察するために、ペア データのパラメトリック テストを実行します。

インフォームドコンセントの署名、包含基準の存在、および除外基準の欠如を確認した後、患者は適格と見なされます。 各患者には、分子分析に使用されるサンプルを識別するシリアル番号が割り当てられ、匿名化されます。

研究期間は、インフォームドコンセントの署名から手術終了後48時間まで延長されます。

研究への参加は、患者の治療計画を変更しません。外科的処置と麻酔の実施は、患者の登録に関係なく、変動のない通常の毎日の臨床診療を表します。

手術室に到着した時点で、患者は手術の種類 (ECG、SpO2、EtCO2、侵襲性血圧) に関連する標準的な臨床診療に従って監視されます。 患者をモニタリングした後、橈骨動脈または上腕動脈に末梢静脈カテーテル ≤ 20 G および動脈カテーテル (20G) を配置します。

十分な酸素化の後、フェンタニル（3 mcg/kg）、プロポフォール（2～2.5 mg/kg）、ロクロニウム（0.6 mg/kg）またはスクシニルコリン（1 mg/Kg）で麻酔を導入します。 麻酔レベルの維持は、セボフルラン 0.7 ～ 1.3 MAC (最小肺胞濃度) の使用と、フェンタニル (1mcg/kg) および場合によってはロクロニウム (0.15mg/kg) のボーラス投与により、終了まで 45 分ごとに得られます。手術。

術後の最初の 48 時間の急性疼痛は、モルヒネの連続静脈内注入 (1 mg/h) で治療されます。患者は、8 分ごとに 1 mg のモルヒネのボーラスを自己投与できます。

モルヒネの連続注入は、0.1 mg/kg のモルヒネの術中ボーラス (最後のステッチの直後) によって先行されます。 患者を目覚めさせてから 10 分後、痛みのコントロールが不十分な場合 (NRS ≧ 4)、モルヒネ 1 mg を投与し、NRS < 3 になるまで 5 分ごとに繰り返します。

術後の吐き気と嘔吐の予防は、フェンタニルの最初の投与量を投与する前に、0.1 mg/kg のデキサメタゾンを静脈内投与することによって実施されます。 術後の吐き気と嘔吐の場合、ドロペリドール 0.625 mg を 6 時間ごとに繰り返し投与します。

調査期間中、人体測定パラメータに加えて、次のデータを収集します。

全身麻酔の導入と覚醒の間の時間として定義される麻酔の持続時間。外科的切開と最後のステッチの間の時間として定義される手術の期間。 mcg/kg/時間で表されるフェンタニル消費量。手術終了後最初の 24 時間および 48 時間のモルヒネ消費;安静時および起床後 10 分、手術終了後 24 および 48 時間の深い吸入後の痛み (NRS)。手術終了後、最初の 24 時間および 48 時間の吐き気と嘔吐の回数。手術終了後最初の 24 時間および 48 時間の制吐薬の消費。

研究期間中、通常の臨床診療に従って実施される血液検査に依存して、5mlの血液サンプルが収集され、エピジェネティック分析が実施される。 サンプルは、ヘパリンまたは EDTA またはアスコルビン酸 ACD を抗凝固剤として添加し、最後の採血後に行われる薬学およびバイオテクノロジー部門への配送まで - 20 ° C の温度で保存されます。

サンプルは、毎日の臨床診療を反映した次のスケジュールに従って収集されます。

• T0: 動脈カテーテルの留置後、アヘン剤の投与前 (ベースラインの血液ガス)。
• T1: 全身麻酔導入の 1 時間後 (人工呼吸器の血液ガス分析検証)。
• T2: 最後のステッチの後、モルヒネの術中ボーラス投与前 (ヘモガス分析検査による失血)。
• T3: 手術終了後 24 ± 6 時間後 (対照血球数);
• T4: 手術終了後 48 ± 6 時間 (対照血球数)。 これらの血液サンプルでは、​​DNA メチル化の程度が評価されます。 サンプルは、ZR-Duet TM キット DNA / RNA Miniprep (Zymo Research) による RNA およびゲノム DNA の抽出に供されます。 サンプルから得られた核酸は、分析まで-80°Cで保存されます。

ゲノム DNA のメチル化の変化はさまざまな疾患で観察されるため、全体的な DNA のメチル化の程度を測定する必要性が非常に重要になっています。 5-mC DNA ELISA キット (Zymo Research) は、ハイスループットで DNA メチル化の程度を簡単に特定および定量化する方法を提供します。

各サンプルから抽出された全 RNA は、RT-qPCR 法を使用した遺伝子発現研究に使用されます。 この技術は、μ オピオイド受容体と DNMT のファミリーに属する酵素をコード化する遺伝子の発現の定量的評価を行うことを可能にします。 これらの結果に基づいて、DNAメチル化の程度を調査した遺伝子の発現レベルと相関させることができます。