DNA-methylering og perioperativ smertebehandling (MEDAPO)

I den perioperative periode oplever kirurgiske patienter dybtgående ændringer i deres fysiologiske processer. Ud over kirurgisk stress skyldes disse variationer til dels farmakologiske behandlinger, der almindeligvis anvendes til anæstesi og analgesi under og efter kirurgisk indgreb.

Opioider er essentielle lægemidler til behandling af akutte perioperative smerter. I de sidste par år har der været meget opmærksomhed på hyperalgesi induceret af opioider, som repræsenterer en klinisk signifikant tilstand efter akut og kronisk eksponering for opioider. Det er blevet foreslået, at stigningen i genekspression af μ-opioidreceptorer og udviklingen af ​​hyperalgesi kunne være forbundet med epigenetiske mekanismer.

Epigenetiske ændringer involverer typisk ændringer i kromatinstrukturen, som er sammensat af DNA, histoner og ikke-histonproteiner. De vigtigste ændringer i kliniske omgivelser er kovalente modifikationer af N-terminale sekvenser af histonproteiner og DNA-methylering. Især DNA-methylering udføres med tilføjelse af en methylgruppe på det femte carbonatom af cytosinrester (5mC), hovedsageligt lokaliseret i CpG-regioner.

DNA-methylering betragtes som en mekanisme til gendæmpning. Det er en kompleks proces, der reguleres af en hel familie af enzymer kaldet DNA-methyl-transferase (DNMT'er: DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3B og DNMT3L), der katalyserer overførslen af ​​en methylgruppe.

Især DNMT 1, 3a, 3b blev undersøgt under udviklingen af ​​en neuropatisk smertemodel. Gennem immunhistokemisk analyse blev det observeret, at i den dorsale rodganglie af en voksen rotte (L4-5) viste DNMT3B en vigtig opregulering, der observeres allerede 1 uge efter induktionen af ​​modellen, og som varer ved i 4 uger; tværtimod viste DNMT1 og DNMT3a en moderat og forbigående opregulering. Andre undersøgelser har vist, at i et andet smertemønster, akut inflammatorisk, er ekspressionsniveauerne af DNMT3a og DNMT3B særligt høje.

Alle disse fund tyder på den vigtige aktivitet af disse enzymer i forskellige smertemodeller.

Opioidadministration synes at være relateret til en stigning i graden af ​​DNA-methylering. I en undersøgelse offentliggjort i 2013, viste Doehring et al. vurderet graden af ​​DNA-methylering hos patienter heroinmisbrugere, der gennemgår metadonsubstitutionsbehandling. Patienter behandlet med opioider har vist en generel stigning i DNA-methylering, især af μ-opioidreceptor. Det er interessant at bemærke, at graden af ​​DNA-methylering korrelerer med intensiteten af ​​smerte rapporteret af forsøgspersoner analyseret i undersøgelsen.

I litteraturen er der ikke på nuværende tidspunkt til stede data relateret til graden af ​​DNA-methylering hos kirurgiske patienter, der modtager akut behandling med opiater, der er opioid-naive før operation.

Det primære formål med denne undersøgelse er at vurdere graden af ​​perioperativ DNA-methylering (ekstraheret fra fuldblod) hos patienter, der gennemgår større operationer udsat for opiater i henhold til gældende klinisk praksis sammenlignet med præoperative baseline-niveauer. Timingen (præoperativ vs intraoperativ vs postoperativ), hvor den mulige stigning i graden af ​​DNA-methylering vil ske, vil blive vurderet.

De sekundære mål er: observere den mulige sammenhæng mellem graden af ​​DNA-methylering og intensiteten af ​​akutte postoperative smerter, observere den mulige sammenhæng mellem graden af ​​DNA-methylering og forekomsten af ​​postoperativ kvalme og opkastning, observere de mulige sammenhænge mellem graden af DNA-methylering og genekspressionen af ​​μ opioidreceptor, observer de mulige korrelationer mellem graden af ​​DNA-methylering og ekspressionen af ​​gener, der hovedsageligt er involveret i methyleringsprocesser, sammenlign graden af ​​DNA-methylering i den præoperative fase af de forskellige patienter involveret i undersøgelsen .

MEDAPO forsøg er et monocentrisk klinisk forsøg med brug af humant væv in vitro. På grund af den manglende viden i litteraturen om den øgede grad af DNA-methylering efter akut administration af opioider til kirurgiske patienter, vil denne undersøgelse være eksplorativ. Da det desuden ikke er muligt at undgå eksponering for opiater i den intraoperative fase, men at det er muligt at garantere postoperativ analgesi uden opioidbehandlinger, vil det være interessant at se, om der sker en stigning i methylering allerede i den intraoperative fase, eller om det kan relateres til tidspunktet for eksponering for behandling med opiater.

Dette vil give nyttig information til bedre at kunne planlægge tidspunktet for randomisering i et fremtidigt forsøg, der sammenligner forskellige postoperative analgetiske teknikker.

20 på hinanden følgende patienter, der gennemgår større operationer udført under generel anæstesi, og som har givet deres samtykke til at deltage i undersøgelsen, vil blive tilmeldt. Denne prøve er tilstrækkelig til at tillade observation af en mulig stigning i DNA-methylering hos opioidnaive patienter, der er udsat for anæstesi/analgesi baseret på opiater i henhold til gældende klinisk praksis.

Deskriptiv analyse relateret til forsøgets primære mål vil blive udført. Vi vil udføre parametriske tests for parrede data for at observere sammenhængen mellem graden af ​​DNA-methylering og akutte postoperative smerter.

Efter at have verificeret underskriften på informeret samtykke, tilstedeværelsen af ​​inklusionskriterierne og fraværet af eksklusionskriterier, vil patienten blive betragtet som kvalificeret. Hver patient vil blive tildelt et serienummer, som vil identificere de prøver, der bruges til molekylær analyse, hvilket gør dem anonyme.

Undersøgelsesperioden vil strække sig fra underskrivelsen af ​​informeret samtykke op til 48 timer efter afslutningen af ​​det kirurgiske indgreb.

Deltagelsen i undersøgelsen vil ikke ændre patientens behandlingsplan: kirurgisk indgreb og bedøvelsesadfærd vil repræsentere den normale daglige kliniske praksis uden nogen variation uanset patientens indskrivning.

Ved ankomst til operationsstuen vil patienten blive overvåget i henhold til standard klinisk praksis i forhold til operationstypen (EKG, SpO2, EtCO2 og invasivt blodtryk). Efter monitorering af patienten vil den blive placeret et perifert venekateter ≤ 20 G og et arteriekateter (20G) i radial eller humeral arterie.

Efter tilstrækkelig iltning vil anæstesi blive induceret med fentanyl (3 mcg/kg), propofol (2-2,5 mg/kg) og Rocuronium (0,6 mg/kg) eller succinylcholin (1 mg/kg). Opretholdelse af anæstesiniveau opnås ved brug af Sevofluran 0,7 - 1,3 MAC (minimum alveolær koncentration) og bolusdoser af Fentanyl (1mcg/kg) og muligvis Rocuronium (0,15mg/kg) hvert 45. minut indtil slutningen af kirurgi.

De akutte postoperative smerter i de første 48 timer vil blive behandlet med en kontinuerlig intravenøs infusion af morfin (1 mg/t), med mulighed for, at patienten selv kan administrere bolus på 1 mg morfin, der kan gentages hvert 8. minut.

Kontinuerlig infusion af morfin vil blive forudgået af en intraoperativ bolus (umiddelbart efter sidste sting) på 0,1 mg/kg morfin. Ti minutter efter opvågning vil patienten, hvis smerten vil være dårligt kontrolleret (NRS ≥ 4), blive administreret 1 mg morfin, som kan gentages hvert 5. minut, indtil NRS <3.

Profylakse mod postoperativ kvalme og opkastning udføres ved intravenøs administration af 0,1 mg/kg dexamethason før administration af den første dosis fentanyl. I tilfælde af postoperativ kvalme og opkastning vil det blive administreret droperidol 0,625 mg, der kan gentages hver 6. time.

I løbet af undersøgelsesperioden vil vi ud over de antropometriske parametre indsamle følgende data:

Varighed af anæstesi, defineret som tiden mellem induktion af generel anæstesi og opvågning; Operationens varighed, defineret som tiden mellem kirurgisk indsnit og sidste sting; Fentanylforbrug, udtrykt i mcg/kg/time; Morfinforbrug i de første 24 og 48 timer efter operationens afslutning; Smerter (NRS) i hvile og efter dyb inhalation 10 minutter efter opvågning, 24 og 48 timer efter operationens afslutning; Antal episoder med kvalme og opkastning i de første 24 og 48 timer efter operationens afslutning; Indtagelse af antiemetika i de første 24 og 48 timer efter operationens afslutning.

I løbet af undersøgelsesperioden, i afhængighed af blodprøver udført i henhold til rutinemæssig klinisk praksis, vil der blive indsamlet en blodprøve på 5 ml for at udføre epigenetisk analyse. Semplen tilsættes heparin eller EDTA eller ascorbat ACD som antikoagulerende midler og opbevares ved en temperatur på -20°C indtil levering til Institut for Farmaci og Bioteknologi, som vil finde sted efter sidste blodprøvetagning.

Prøver vil blive indsamlet i henhold til følgende tidsplan, der afspejler daglig klinisk praksis:

• T0: efter anbringelse af arteriekateteret, før administration af opiater (baseline blodgasser);
• T1: 1 time efter generel anæstesi induktion (hæmogasanalyse verifikation af mekanisk ventilation);
• T2: efter det sidste sting, før den intraoperative bolus morfin (hæmogasanalyse, der tester blodtab);
• T3: 24 ± 6 timer efter operationens afslutning (kontrolblodtælling);
• T4: 48 ± 6 timer efter operationens afslutning (kontrolblodtælling). På disse blodprøver vil det blive vurderet graden af ​​DNA-methylering. Prøverne vil blive udsat for ekstraktion af RNA og genomisk DNA gennem ZR-Duet™ kit DNA / RNA Miniprep (Zymo Research). Nukleinsyrerne opnået fra prøverne vil blive opbevaret ved -80 °C indtil analyse.

Da ændringen i methylering af genomisk DNA observeres i forskellige sygdomme, er behovet for at måle graden af ​​samlet DNA-methylering blevet meget vigtigt. 5-mC DNA ELISA-kittet (Zymo Research) tilbyder en metode med høj gennemstrømning, let at identificere og kvantificere graden af ​​DNA-methylering.

Total RNA ekstraheret fra hver prøve vil blive brugt til genekspressionsundersøgelser ved hjælp af RT-qPCR-metoden. Denne teknik vil gøre det muligt at foretage en kvantitativ vurdering af genernes ekspression, der kodificerer for μ opioidreceptoren og enzymer, der tilhører familien af ​​DNMT'er. Baseret på disse resultater vil vi være i stand til at korrelere graden af ​​DNA-methylering til niveauerne af ekspression af de undersøgte gener.