Methylace DNA a léčba perioperační bolesti (MEDAPO)

V perioperačním období dochází u chirurgických pacientů k hlubokým změnám ve fyziologických procesech. Kromě chirurgického stresu jsou tyto variace částečně způsobeny farmakologickou léčbou běžně používanou pro anestezii a analgezii během chirurgického zákroku a po něm.

Opioidy jsou základní léky pro zvládání akutní perioperační bolesti. V posledních několika letech byla věnována velká pozornost hyperalgezii vyvolané opioidy, která představuje klinicky významný stav po akutní a chronické expozici opioidům. Bylo navrženo, že zvýšení genové exprese μ-opioidních receptorů a rozvoj hyperalgezie by mohly být spojeny s epigenetickými mechanismy.

Epigenetické změny typicky zahrnují změny ve struktuře chromatinu, který se skládá z DNA, histonů a nehistonových proteinů. Hlavními změnami v klinickém prostředí jsou kovalentní modifikace N-terminálních sekvencí histonových proteinů a metylace DNA. Konkrétně methylace DNA se provádí přidáním methylové skupiny na pátý atom uhlíku cytosinových zbytků (5mC), lokalizovaných hlavně v oblastech CpG.

Metylace DNA je považována za mechanismus umlčování genů. Jde o komplexní proces regulovaný celou rodinou enzymů nazývaných DNA methyltransferáza (DNMT: DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3B a DNMT3L), které katalyzují přenos methylové skupiny.

Během vývoje modelu neuropatické bolesti byly studovány zejména DNMT 1, 3a, 3b. Prostřednictvím imunohistochemické analýzy bylo pozorováno, že v dorzálním kořenovém ganglionu dospělého potkana (L4-5) DNMT3B vykazoval důležitou up-regulaci, která je pozorována již 1 týden po indukci modelu a která přetrvává po dobu 4 týdnů; naopak DNMT1 a DNMT3a vykazovaly mírnou a přechodnou up-regulaci. Jiné studie ukázaly, že u odlišného vzorce bolesti, akutního zánětu, jsou hladiny exprese DNMT3a a DNMT3B obzvláště vysoké.

Všechna tato zjištění naznačují důležitou aktivitu těchto enzymů v různých modelech bolesti.

Zdá se, že podávání opiátů souvisí se zvýšením stupně metylace DNA. Ve studii publikované v roce 2013 Doehring et al. hodnotili stupeň metylace DNA u pacientů závislých na heroinu podstupujících metadonovou substituční léčbu. U pacientů léčených opioidy došlo k celkovému zvýšení metylace DNA, zejména μ-opioidního receptoru. Je zajímavé poznamenat, že stupeň methylace DNA koreluje s intenzitou bolesti hlášenou subjekty analyzovanými ve studii.

V literatuře nejsou v současnosti k dispozici údaje týkající se stupně metylace DNA u chirurgických pacientů, kteří před operací dostávali akutní léčbu opiáty, které opioidy dosud nebyly.

Primárním cílem této studie je zhodnotit stupeň perioperační metylace DNA (extrahované z plné krve) u pacientů podstupujících velký chirurgický výkon vystavených opiátům podle současné klinické praxe ve srovnání s předoperačními výchozími hladinami. Bude posouzeno načasování (předoperační vs. intraoperační vs pooperační), ve kterém dojde k možnému zvýšení stupně metylace DNA.

Sekundární cíle jsou: sledovat možnou korelaci mezi stupněm metylace DNA a intenzitou akutní pooperační bolesti, sledovat možnou korelaci mezi stupněm metylace DNA a výskytem pooperační nevolnosti a zvracení, sledovat možné korelace mezi stupněm metylace DNA Metylace DNA a genová exprese μ opioidního receptoru, pozorovat možné korelace mezi stupněm metylace DNA a expresí genů, které se převážně podílejí na metylačních procesech, porovnat stupeň metylace DNA v předoperační fázi u různých pacientů zapojených do studie .

MEDAPO studie je monocentrická klinická studie s použitím lidské tkáně in vitro. Vzhledem k nedostatku znalostí v literatuře o zvýšeném stupni metylace DNA po akutním podání opioidů u chirurgických pacientů, bude tato studie explorativní. Navíc vzhledem k tomu, že se nelze vyhnout expozici opiátům v intraoperační fázi, ale je možné zaručit pooperační analgezii bez léčby opioidy, bude zajímavé sledovat, zda k nějakému zvýšení metylace dojde již během intraoperační fáze nebo zda to může souviset s doba expozice léčbě opiáty.

To poskytne užitečné informace pro lepší plánování načasování randomizace do budoucí studie srovnávající různé pooperační analgetické techniky.

Bude zařazeno 20 po sobě jdoucích pacientů podstupujících velký chirurgický výkon v celkové anestezii, kteří vyjádřili svůj souhlas s účastí ve studii. Tento vzorek je dostatečný k tomu, aby umožnil pozorování možného zvýšení metylace DNA u pacientů dosud neléčených opioidy vystavených anestezii/analgezii na bázi opiátů podle současné klinické praxe.

Bude provedena popisná analýza související s primárním cílem studie. Provedeme parametrické testy pro párová data, abychom sledovali korelaci mezi stupněm metylace DNA a akutní pooperační bolestí.

Po ověření podpisu informovaného souhlasu, přítomnosti kritérií pro zařazení a absence kritérií pro vyloučení bude pacient považován za způsobilého. Každému pacientovi bude přiděleno sériové číslo, které bude identifikovat vzorky použité pro molekulární analýzu, čímž se stane anonymní.

Doba studie bude trvat od podpisu informovaného souhlasu do 48 hodin po ukončení chirurgického výkonu.

Účast ve studii nezmění léčebný plán pacienta: chirurgický výkon a anestetické vedení budou představovat běžnou každodenní klinickou praxi bez jakýchkoliv změn bez ohledu na zařazení pacienta.

V době příjezdu na operační sál bude pacient sledován dle standardní klinické praxe ve vztahu k typu operace (EKG, SpO2, EtCO2 a invazivní krevní tlak). Po monitorování pacienta bude zaveden periferní žilní katétr ≤ 20 G a arteriální katétr (20G) do radiální nebo humerální tepny.

Po adekvátní oxygenaci bude vyvolána anestézie fentanylem (3 mcg/kg), propofolem (2-2,5 mg/kg) a rokuroniem (0,6 mg/kg) nebo sukcinylcholinem (1 mg/kg). Udržení hladiny anestetika bude dosaženo použitím Sevofluranu 0,7 - 1,3 MAC (minimální alveolární koncentrace) a bolusových dávek Fentanylu (1 mcg/kg) a případně rokuronia (0,15 mg/kg) každých 45 minut až do konce chirurgická operace.

Akutní pooperační bolest v prvních 48 hodinách bude léčena kontinuální intravenózní infuzí morfinu (1 mg/h), s možností pacienta samostatně si aplikovat bolusy 1 mg morfinu opakovatelné každých 8 minut.

Kontinuální infuzi morfinu bude předcházet intraoperační bolus (bezprostředně po posledním stehu) 0,1 mg/kg morfinu. Deset minut po probuzení bude pacientovi, pokud bude bolest špatně kontrolována (NRS ≥ 4), podán 1 mg morfinu, opakovatelné každých 5 minut, až do NRS<3.

Profylaxe pooperační nevolnosti a zvracení bude prováděna intravenózním podáním 0,1 mg/kg dexamethasonu před podáním první dávky fentanylu. V případě pooperační nevolnosti a zvracení bude podán droperidol 0,625 mg opakovatelně každých 6 hodin.

Během období studie budeme kromě antropometrických parametrů shromažďovat následující údaje:

Doba trvání anestezie, definovaná jako doba mezi uvedením celkové anestezie a probuzením; Délka operace, definovaná jako doba mezi chirurgickým řezem a posledním stehem; spotřeba fentanylu, vyjádřená v mcg/kg/hodinu; spotřeba morfinu v prvních 24 a 48 hodinách po ukončení operace; Bolest (NRS) v klidu a po hlubokém nádechu 10 minut po probuzení, 24 a 48 hodin po ukončení operace; Počet epizod nauzey a zvracení během prvních 24 a 48 hodin po ukončení operace; Spotřeba antiemetik v prvních 24 a 48 hodinách po ukončení operace.

V průběhu studie bude v závislosti na krevních testech prováděných podle běžné klinické praxe odebrán vzorek krve o objemu 5 ml k provedení epigenetické analýzy. Vzorek bude doplněn heparinem nebo EDTA nebo askorbátem ACD jako antikoagulačními činidly a skladován při teplotě -20 °C až do doručení na Ústav farmacie a biotechnologie, které proběhne po posledním odběru krve.

Vzorky budou odebírány podle následujícího harmonogramu, který odráží každodenní klinickou praxi:

• T0: po zavedení arteriálního katétru, před podáním opiátů (základní krevní plyny);
• T1: 1 hodina po navození celkové anestezie (ověření mechanické ventilace hemogasanalýzou);
• T2: po posledním stehu, před intraoperačním bolusem morfinu (hemogasanalýza testující ztrátu krve);
• T3: 24 ± 6 hodin po ukončení operace (kontrolní krevní obraz);
• T4: 48 ± 6 hodin po ukončení operace (kontrolní krevní obraz). Na těchto vzorcích krve bude hodnocen stupeň metylace DNA. Vzorky budou podrobeny extrakci RNA a genomové DNA pomocí soupravy ZR-Duet™ DNA / RNA Miniprep (Zymo Research). Nukleové kyseliny získané ze vzorků budou až do analýzy skladovány při -80 °C.

Vzhledem k tomu, že změna metylace genomové DNA je pozorována u různých onemocnění, nutnost měřit stupeň celkové metylace DNA se stala velmi důležitou. Sada 5mC DNA ELISA (Zymo Research) nabízí vysoce výkonnou metodu, kterou lze snadno identifikovat a kvantifikovat stupeň metylace DNA.

Celková RNA extrahovaná z každého vzorku bude použita pro studie genové exprese metodou RT-qPCR. Tato technika umožní provést kvantitativní hodnocení exprese genů kódujících μ opioidní receptor a enzymy patřící do rodiny DNMT. Na základě těchto výsledků budeme schopni korelovat stupeň metylace DNA s úrovněmi exprese zkoumaných genů.