Metilazione del DNA e trattamento del dolore perioperatorio (MEDAPO)

Durante il periodo perioperatorio i pazienti chirurgici sperimentano profondi cambiamenti nei loro processi fisiologici. Oltre allo stress chirurgico, queste variazioni sono in parte dovute ai trattamenti farmacologici comunemente utilizzati per l'anestesia e l'analgesia durante e dopo l'intervento chirurgico.

Gli oppioidi sono farmaci essenziali per la gestione del dolore perioperatorio acuto. Negli ultimi anni è stata prestata molta attenzione all'iperalgesia indotta da oppioidi, che rappresenta una condizione clinicamente significativa a seguito di esposizione acuta e cronica agli oppioidi. È stato suggerito che l'aumento dell'espressione genica dei recettori μ-oppioidi e lo sviluppo dell'iperalgesia potrebbero essere collegati a meccanismi epigenetici.

Le alterazioni epigenetiche tipicamente comportano cambiamenti nella struttura della cromatina, che è composta da DNA, istoni e proteine ​​non istoniche. I principali cambiamenti in ambito clinico sono le modifiche covalenti delle sequenze N-terminali delle proteine ​​istoniche e la metilazione del DNA. In particolare, la metilazione del DNA viene effettuata con l'aggiunta di un gruppo metilico sul quinto atomo di carbonio dei residui di citosina (5mC), localizzati principalmente nelle regioni CpG.

La metilazione del DNA è considerata un meccanismo di silenziamento genico. È un processo complesso regolato da un'intera famiglia di enzimi chiamati DNA metil-transferasi (DNMT: DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3B e DNMT3L) che catalizzano il trasferimento di un gruppo metilico.

In particolare DNMT 1, 3a, 3b sono stati studiati durante lo sviluppo di un modello di dolore neuropatico. Attraverso l'analisi immunoistochimica è stato osservato che nel ganglio della radice dorsale di un ratto adulto (L4-5) DNMT3B ha mostrato un'importante up-regulation che si osserva già 1 settimana dopo l'induzione del modello e che persiste per 4 settimane; al contrario, DNMT1 e DNMT3a hanno mostrato una sovraregolazione moderata e transitoria. Altri studi hanno dimostrato che in un diverso pattern di dolore, infiammatorio acuto, i livelli di espressione di DNMT3a e DNMT3B sono particolarmente elevati.

Tutti questi risultati suggeriscono l'importante attività di questi enzimi in diversi modelli di dolore.

La somministrazione di oppioidi sembra essere correlata ad un aumento del grado di metilazione del DNA. In uno studio pubblicato nel 2013, Doehring et al. valutato il grado di metilazione del DNA nei pazienti eroinomani sottoposti a trattamento sostitutivo con metadone. I pazienti trattati con oppioidi hanno mostrato un aumento complessivo della metilazione del DNA, in particolare del recettore μ-oppioide. È interessante notare che il grado di metilazione del DNA è correlato all'intensità del dolore riportato dai soggetti analizzati nello studio.

In letteratura non sono attualmente presenti dati relativi al grado di metilazione del DNA nei pazienti chirurgici sottoposti a trattamento acuto con oppiacei naive agli oppioidi prima dell'intervento chirurgico.

L'obiettivo primario di questo studio è valutare il grado di metilazione perioperatoria del DNA (estratto da sangue intero) in pazienti sottoposti a chirurgia maggiore esposti agli oppiacei secondo l'attuale pratica clinica rispetto ai livelli basali preoperatori. Verrà valutato il timing (preoperatorio vs intraoperatorio vs postoperatorio) in cui avverrà l'eventuale aumento del grado di metilazione del DNA.

Gli obiettivi secondari sono: osservare la possibile correlazione tra il grado di metilazione del DNA e l'intensità del dolore acuto postoperatorio, osservare la possibile correlazione tra il grado di metilazione del DNA e l'incidenza di nausea e vomito postoperatori, osservare le possibili correlazioni tra il grado di Metilazione del DNA ed espressione genica del recettore oppioide μ, osservare le possibili correlazioni tra il grado di metilazione del DNA e l'espressione dei geni principalmente coinvolti nei processi di metilazione, confrontare il grado di metilazione del DNA nella fase preoperatoria dei diversi pazienti coinvolti nello studio .

Lo studio MEDAPO è uno studio clinico monocentrico con l'uso di tessuto umano in vitro. A causa della mancanza di conoscenza in letteratura sull'aumento del grado di metilazione del DNA dopo la somministrazione acuta di oppioidi nei pazienti chirurgici, questo studio sarà esplorativo. Inoltre, non potendo evitare l'esposizione agli oppiacei nella fase intraoperatoria, ma potendo garantire l'analgesia postoperatoria senza trattamenti oppioidi, sarà interessante vedere se qualche aumento della metilazione si verifica già durante la fase intraoperatoria o se può essere correlato a il tempo di esposizione al trattamento con oppiacei.

Ciò fornirà informazioni utili per pianificare meglio i tempi per la randomizzazione in una sperimentazione futura confrontando varie tecniche analgesiche postoperatorie.

Saranno arruolati 20 pazienti consecutivi sottoposti a chirurgia maggiore eseguita in anestesia generale che hanno espresso il proprio consenso a partecipare allo studio. Questo campione è adeguato per consentire l'osservazione di un possibile aumento della metilazione del DNA in pazienti naive agli oppioidi esposti ad anestesia/analgesia a base di oppiacei secondo l'attuale pratica clinica.

Verrà eseguita un'analisi descrittiva relativa all'obiettivo primario della sperimentazione. Effettueremo test parametrici per dati appaiati per osservare la correlazione tra il grado di metilazione del DNA e il dolore postoperatorio acuto.

Dopo aver verificato la firma del consenso informato, la presenza dei criteri di inclusione e l'assenza di criteri di esclusione, il paziente sarà considerato idoneo. Ad ogni paziente verrà assegnato un numero seriale che identificherà i campioni utilizzati per le analisi molecolari rendendoli anonimi.

Il periodo di studio si estenderà dalla firma del consenso informato fino a 48 ore dopo la fine della procedura chirurgica.

La partecipazione allo studio non modificherà il piano di trattamento del paziente: la procedura chirurgica e la condotta anestesiologica rappresenteranno la normale pratica clinica quotidiana senza alcuna variazione indipendentemente dall'arruolamento del paziente.

Al momento dell'arrivo in sala operatoria il paziente sarà monitorato secondo la pratica clinica standard in relazione al tipo di intervento (ECG, SpO2, EtCO2 e Pressione Invasiva). Dopo aver monitorato il paziente, verrà posizionato un catetere venoso periferico ≤ 20 G e un catetere arterioso (20 G) in arteria radiale o omerale.

Dopo adeguata ossigenazione verrà indotta l'anestesia con fentanyl (3 mcg/kg), propofol (2-2.5 mg/kg) e rocuronio (0.6 mg/kg) o succinilcolina (1 mg/kg). Il mantenimento del livello di anestetico sarà ottenuto mediante l'uso di Sevoflurano 0,7 - 1,3 MAC (concentrazione alveolare minima), e dosi in bolo di Fentanyl (1mcg/kg) ed eventualmente di Rocuronio (0,15mg/kg) ogni 45 minuti fino alla fine del chirurgia.

Il dolore acuto postoperatorio nelle prime 48 ore verrà trattato con un'infusione endovenosa continua di morfina (1 mg/h), con la possibilità da parte del paziente di autosomministrarsi boli di 1 mg di morfina ripetibili ogni 8 minuti.

L'infusione continua di morfina sarà preceduta da un bolo intraoperatorio (immediatamente dopo l'ultimo punto) di 0,1 mg/kg di morfina. Dieci minuti dopo il risveglio al paziente, se il dolore sarà scarsamente controllato (NRS ≥ 4), verrà somministrato 1 mg di morfina, ripetibile ogni 5 minuti, fino a NRS<3.

La profilassi della nausea e del vomito postoperatori verrà effettuata mediante somministrazione endovenosa di 0,1 mg/kg di desametasone prima della somministrazione della prima dose di fentanil. In caso di nausea e vomito postoperatori, verrà somministrato droperidolo 0,625 mg ripetibile ogni 6 ore.

Durante il periodo di studio, oltre ai parametri antropometrici, raccoglieremo i seguenti dati:

Durata dell'anestesia, definita come il tempo che intercorre tra l'induzione dell'anestesia generale e il risveglio; Durata dell'intervento, definita come il tempo che intercorre tra l'incisione chirurgica e l'ultimo punto; Consumo di fentanil, espresso in mcg/kg/ora; Consumo di morfina nelle prime 24 e 48 ore dopo la fine dell'intervento; Dolore (NRS) a riposo e dopo inalazione profonda 10 minuti dopo il risveglio, 24 e 48 ore dopo la fine dell'intervento; Numero di episodi di nausea e vomito nelle prime 24 e 48 ore dopo la fine dell'intervento; Consumo di farmaci antiemetici nelle prime 24 e 48 ore dopo la fine dell'intervento.

Durante il periodo di studio, oltre agli esami del sangue eseguiti secondo la pratica clinica di routine, verrà prelevato un campione di sangue di 5 ml per eseguire analisi epigenetiche. Il campione verrà addizionato con eparina o EDTA o ascorbato ACD come agenti anticoagulanti e conservato ad una temperatura di -20°C fino alla consegna al Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie che avverrà dopo l'ultimo prelievo di sangue.

I campioni saranno raccolti secondo il seguente programma che riflette la pratica clinica quotidiana:

• T0: dopo il posizionamento del catetere arterioso, prima della somministrazione di oppiacei (emogasanalisi basale);
• T1: 1 ora dopo l'induzione dell'anestesia generale (verifica dell'emogasanalisi della ventilazione meccanica);
• T2: dopo l'ultimo punto, prima del bolo intraoperatorio di morfina (emogasanalisi che verifica la perdita di sangue);
• T3: 24 ± 6 ore dopo la fine dell'intervento (conta ematica di controllo);
• T4: 48 ± 6 ore dopo la fine dell'intervento (controllo della conta ematica). Su questi campioni di sangue verrà valutato il grado di metilazione del DNA. I campioni saranno sottoposti ad estrazione di RNA e DNA genomico tramite ZR-Duet™ kit DNA/RNA Miniprep (Zymo Research). Gli acidi nucleici ottenuti dai campioni saranno conservati a -80°C fino al momento dell'analisi.

Poiché il cambiamento nella metilazione del DNA genomico si osserva in varie malattie, la necessità di misurare il grado di metilazione complessiva del DNA è diventata molto importante. Il kit 5-mC DNA ELISA (Zymo Research) offre un metodo ad alto rendimento, facile da identificare e quantificare il grado di metilazione del DNA.

L'RNA totale estratto da ciascun campione sarà utilizzato per studi di espressione genica utilizzando il metodo RT-qPCR. Questa tecnica consentirà di effettuare una valutazione quantitativa dell'espressione dei geni codificanti per il recettore μ degli oppioidi e degli enzimi appartenenti alla famiglia dei DNMT. Sulla base di questi risultati, saremo in grado di correlare il grado di metilazione del DNA ai livelli di espressione dei geni studiati.