Metilação do DNA e tratamento da dor perioperatória (MEDAPO)

Durante o período perioperatório, os pacientes cirúrgicos experimentam profundas mudanças em seus processos fisiológicos. Além do estresse cirúrgico, essas variações se devem, em parte, aos tratamentos farmacológicos comumente utilizados para anestesia e analgesia durante e após o procedimento cirúrgico.

Os opioides são medicamentos essenciais para o manejo da dor perioperatória aguda. Nos últimos anos, muita atenção tem sido dada à hiperalgesia induzida por opioides, que representa uma condição clinicamente significativa após exposição aguda e crônica a opioides. Tem sido sugerido que o aumento da expressão gênica dos receptores μ-opióides e o desenvolvimento de hiperalgesia podem estar ligados a mecanismos epigenéticos.

As alterações epigenéticas normalmente envolvem mudanças na estrutura da cromatina, que é composta de DNA, histonas e proteínas não histonas. As principais mudanças no cenário clínico são modificações covalentes de sequências N-terminais de proteínas histonas e metilação do DNA. Em particular, a metilação do DNA é realizada com a adição de um grupo metil no quinto átomo de carbono dos resíduos de citosina (5mC), localizados principalmente nas regiões CpG.

A metilação do DNA é considerada um mecanismo de silenciamento de genes. É um processo complexo regulado por toda uma família de enzimas chamadas DNA metiltransferase (DNMTs: DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3B e DNMT3L) que catalisam a transferência de um grupo metil.

Em particular, DNMT 1, 3a, 3b foram estudados durante o desenvolvimento de um modelo de dor neuropática. Através da análise imuno-histoquímica observou-se que no gânglio da raiz dorsal de um rato adulto (L4-5) o DNMT3B apresentou um importante up-regulation que se observa já 1 semana após a indução do modelo e que persiste por 4 semanas; pelo contrário, DNMT1 e DNMT3a mostraram uma regulação positiva moderada e transitória. Outros estudos mostraram que em um padrão diferente de dor, inflamatória aguda, os níveis de expressão de DNMT3a e DNMT3B são particularmente altos.

Todos esses achados sugerem a importante atividade dessas enzimas em diferentes modelos de dor.

A administração de opioides parece estar relacionada a um aumento do grau de metilação do DNA. Em estudo publicado em 2013, Doehring et al. avaliaram o grau de metilação do DNA em pacientes viciados em heroína em tratamento de substituição com metadona. Os pacientes tratados com opioides mostraram um aumento geral na metilação do DNA, em particular do receptor μ-opioide. É interessante notar que o grau de metilação do DNA se correlaciona com a intensidade da dor relatada pelos sujeitos analisados ​​no estudo.

Na literatura não há atualmente dados relacionados ao grau de metilação do DNA em pacientes cirúrgicos recebendo tratamento agudo com opiáceos virgens de opioides antes da cirurgia.

O objetivo principal deste estudo é avaliar o grau de metilação perioperatória do DNA (extraído do sangue total) em pacientes submetidos a cirurgias de grande porte expostos a opiáceos de acordo com a prática clínica atual em comparação com os níveis basais pré-operatórios. Será avaliado o momento (pré-operatório vs intraoperatório vs pós-operatório) em que ocorrerá o possível aumento do grau de metilação do DNA.

Os objetivos secundários são: observar a possível correlação entre o grau de metilação do DNA e a intensidade da dor aguda pós-operatória, observar a possível correlação entre o grau de metilação do DNA e a incidência de náuseas e vômitos pós-operatórios, observar as possíveis correlações entre o grau de A metilação do DNA e a expressão gênica do receptor opioide μ, observar as possíveis correlações entre o grau de metilação do DNA e a expressão de genes principalmente envolvidos nos processos de metilação, comparar o grau de metilação do DNA na fase pré-operatória dos diferentes pacientes envolvidos no estudo .

O estudo MEDAPO é um ensaio clínico monocêntrico com o uso de tecido humano in vitro. Devido à falta de conhecimento na literatura sobre o aumento do grau de metilação do DNA após a administração aguda de opioides em pacientes cirúrgicos, este estudo será exploratório. Além disso, não podendo evitar a exposição aos opiáceos no intraoperatório, mas sendo possível garantir analgesia pós-operatória sem tratamentos opióides, será interessante verificar se algum aumento da metilação ocorre já no intraoperatório ou se pode estar relacionado a o tempo de exposição ao tratamento com opiáceos.

Isso fornecerá informações úteis para planejar melhor o momento da randomização em um estudo futuro comparando várias técnicas analgésicas pós-operatórias.

Serão incluídos 20 pacientes consecutivos submetidos a cirurgias de grande porte realizadas sob anestesia geral que tenham expressado seu consentimento em participar do estudo. Esta amostra é adequada para permitir a observação de um possível aumento da metilação do DNA em pacientes virgens de opioides expostos a anestesia/analgesia baseada em opiáceos de acordo com a prática clínica atual.

Será realizada análise descritiva relacionada ao objetivo primário do estudo. Faremos testes paramétricos de dados pareados para observar a correlação entre o grau de metilação do DNA e a dor aguda pós-operatória.

Após verificada a assinatura do consentimento informado, a presença dos critérios de inclusão e a ausência de critérios de exclusão, o paciente será considerado elegível. A cada paciente será atribuído um número de série que identificará as amostras utilizadas para análise molecular tornando-as anônimas.

O período do estudo se estenderá desde a assinatura do consentimento informado até 48 horas após o término do procedimento cirúrgico.

A participação no estudo não alterará o plano de tratamento do paciente: o procedimento cirúrgico e a conduta anestésica representarão a prática clínica diária normal, sem qualquer variação, independentemente da inscrição do paciente.

No momento da chegada à sala cirúrgica o paciente será monitorado de acordo com a prática clínica padrão em relação ao tipo de cirurgia (ECG, SpO2, EtCO2 e Pressão Arterial Invasiva). Após o acompanhamento do paciente, será colocado um cateter venoso periférico ≤ 20 G e um cateter arterial (20G) em artéria radial ou umeral.

Após adequada oxigenação, a anestesia será induzida com fentanil (3 mcg/kg), propofol (2-2,5 mg/kg) e rocurônio (0,6 mg/kg) ou succinilcolina (1 mg/kg). A manutenção do nível anestésico será obtida com o uso de Sevoflurano 0,7 - 1,3 CAM (concentração alveolar mínima), e doses em bolus de Fentanil (1mcg/kg) e possivelmente de Rocurônio (0,15mg/kg) a cada 45 minutos até o final da cirurgia.

A dor aguda pós-operatória nas primeiras 48 horas será tratada com infusão endovenosa contínua de morfina (1 mg/h), podendo o paciente auto-administrar bolus de 1 mg de morfina repetíveis a cada 8 minutos.

A infusão contínua de morfina será precedida de um bolus intraoperatório (imediatamente após o último ponto) de 0,1 mg/kg de morfina. Dez minutos após acordar o paciente, se a dor estiver mal controlada (NRS ≥ 4), será administrado 1 mg de morfina, repetível a cada 5 minutos, até NRS <3.

A profilaxia para náuseas e vômitos pós-operatórios será realizada pela administração intravenosa de 0,1 mg/kg de dexametasona antes da administração da primeira dose de fentanil. Em caso de náuseas e vômitos pós-operatórios, será administrado droperidol 0,625 mg repetível a cada 6 horas.

Durante o período do estudo, além dos parâmetros antropométricos, coletaremos os seguintes dados:

Duração da anestesia, definida como o tempo entre a indução da anestesia geral e o despertar; Duração da cirurgia, definida como o tempo entre a incisão cirúrgica e o último ponto; Consumo de fentanil, expresso em mcg/kg/hora; Consumo de morfina nas primeiras 24 e 48 horas após o término da cirurgia; Dor (END) em repouso e após inspiração profunda 10 minutos após acordar, 24 e 48 horas após o término da cirurgia; Número de episódios de náuseas e vômitos nas primeiras 24 e 48 horas após o término da cirurgia; Consumo de antieméticos nas primeiras 24 e 48 horas após o término da cirurgia.

Durante o período do estudo, além dos exames de sangue realizados de acordo com a prática clínica de rotina, será coletada uma amostra de 5 ml de sangue para realização de análises epigenéticas. A amostra será acrescida de heparina ou EDTA ou ascorbato ACD como agentes anticoagulantes e armazenada a uma temperatura de -20°C até a entrega ao Departamento de Farmácia e Biotecnologia que ocorrerá após a última coleta de sangue.

As amostras serão coletadas de acordo com o seguinte cronograma que reflete a prática clínica diária:

• T0: após a colocação do cateter arterial, antes da administração de opiáceos (gasometria basal);
• T1: 1 hora após a indução da anestesia geral (verificação da hemogasanálise da ventilação mecânica);
• T2: após o último ponto, antes do bolus intraoperatório de morfina (hemogasanálise testando perda sanguínea);
• T3: 24 ± 6 horas após o término da cirurgia (hemograma de controle);
• T4: 48 ± 6 horas após o término da cirurgia (hemograma de controle). Nessas amostras de sangue, será avaliado o grau de metilação do DNA. As amostras serão submetidas à extração de RNA e DNA genômico através do kit ZR-Duet™ DNA/RNA Miniprep (Zymo Research). Os ácidos nucléicos obtidos das amostras serão armazenados a -80°C até a análise.

Uma vez que a alteração na metilação do DNA genômico é observada em várias doenças, a necessidade de medir o grau de metilação geral do DNA tornou-se muito importante. O kit 5-mC DNA ELISA (Zymo Research) oferece um método de alto rendimento, fácil de identificar e quantificar o grau de metilação do DNA.

O RNA total extraído de cada amostra será utilizado para estudos de expressão gênica pelo método RT-qPCR. Esta técnica permitirá fazer uma avaliação quantitativa da expressão de genes que codificam para o receptor opióide μ e enzimas pertencentes à família das DNMTs. Com base nesses resultados, poderemos correlacionar o grau de metilação do DNA com os níveis de expressão dos genes investigados.