DNA-metylaatio ja perioperatiivinen kivunhoito (MEDAPO)

Perioperatiivisen jakson aikana kirurgiset potilaat kokevat syvällisiä muutoksia fysiologisissa prosesseissaan. Kirurgisen stressin lisäksi nämä vaihtelut johtuvat osittain farmakologisista hoidoista, joita käytetään yleisesti anestesiassa ja analgesiassa kirurgisen toimenpiteen aikana ja sen jälkeen.

Opioidit ovat välttämättömiä lääkkeitä akuutin perioperatiivisen kivun hoidossa. Muutaman viime vuoden aikana on kiinnitetty paljon huomiota opioidien aiheuttamaan hyperalgesiaan, joka edustaa kliinisesti merkittävää tilaa akuutin ja kroonisen opioidialtistuksen jälkeen. On ehdotettu, että μ-opioidireseptorien geeniekspression lisääntyminen ja hyperalgesian kehittyminen voisivat olla yhteydessä epigeneettisiin mekanismeihin.

Epigeneettiset muutokset sisältävät tyypillisesti muutoksia kromatiinin rakenteessa, joka koostuu DNA:sta, histoneista ja ei-histoniproteiineista. Tärkeimmät muutokset kliinisessä ympäristössä ovat histoniproteiinien N-terminaalisten sekvenssien kovalenttiset modifikaatiot ja DNA:n metylaatio. Erityisesti DNA-metylaatio suoritetaan lisäämällä metyyliryhmä sytosiinitähteiden viidenteen hiiliatomiin (5 mC), joka sijaitsee pääasiassa CpG-alueilla.

DNA:n metylaatiota pidetään geenin vaimentamisen mekanismina. Se on monimutkainen prosessi, jota säätelee koko perhe DNA-metyylitransferaasiksi kutsuttuja entsyymejä (DNMT:t: DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3B ja DNMT3L), jotka katalysoivat metyyliryhmän siirtoa.

Erityisesti DNMT 1, 3a, 3b tutkittiin neuropaattisen kipumallin kehittämisen aikana. Immunohistokemiallisen analyysin avulla havaittiin, että aikuisen rotan (L4-5) selkäjuuren ganglionissa DNMT3B osoitti tärkeää ylössäätelyä, joka havaitaan jo 1 viikko mallin induktion jälkeen ja joka jatkuu 4 viikkoa; päinvastoin, DNMT1 ja DNMT3a osoittivat kohtalaista ja ohimenevää ylössäätelyä. Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että erilaisessa kipumallissa, akuutissa tulehduksessa, DNMT3a:n ja DNMT3B:n ilmentymistasot ovat erityisen korkeat.

Kaikki nämä havainnot viittaavat näiden entsyymien tärkeään aktiivisuuteen erilaisissa kipumalleissa.

Opioidien antaminen näyttää liittyvän DNA:n metylaatioasteen lisääntymiseen. Vuonna 2013 julkaistussa tutkimuksessa Doehring et al. arvioi DNA-metylaatioasteen metadonikorvaushoitoa saavilla heroiiniriippuvaisilla potilailla. Opioideilla hoidetuilla potilailla DNA:n metylaatio, erityisesti μ-opioidireseptorin, on lisääntynyt yleisesti. On mielenkiintoista huomata, että DNA:n metylaatioaste korreloi tutkimuksessa analysoitujen koehenkilöiden raportoiman kivun voimakkuuden kanssa.

Kirjallisuudessa ei tällä hetkellä ole tietoa DNA-metylaatioasteesta kirurgisilla potilailla, jotka saavat akuuttia hoitoa opioideilla ennen leikkausta.

Tämän tutkimuksen ensisijaisena tavoitteena on arvioida perioperatiivisen DNA:n metylaation (kokoverestä uutetun) astetta potilailla, joille tehdään suuri leikkaus ja jotka ovat altistuneet opiaateille nykyisen kliinisen käytännön mukaisesti verrattuna leikkausta edeltäviin lähtötasoihin. Arvioidaan ajoitus (preoperatiivinen vs intraoperatiivinen vs postoperatiivinen), jolloin DNA:n metylaatioasteen mahdollinen lisääntyminen tapahtuu.

Toissijaisia ​​tavoitteita ovat: tarkkailla mahdollista korrelaatiota DNA:n metylaatioasteen ja akuutin postoperatiivisen kivun voimakkuuden välillä, tarkkailla mahdollista korrelaatiota DNA:n metylaatioasteen ja postoperatiivisen pahoinvoinnin ja oksentelun esiintyvyyden välillä, tarkkailla mahdollisia korrelaatioita leikkauksen jälkeisen kivun asteen välillä. DNA-metylaatio ja μ opioidireseptorin geeniekspressio, tarkkaile mahdollisia korrelaatioita DNA:n metylaatioasteen ja pääasiassa metylaatioprosesseihin osallistuvien geenien ilmentymisen välillä, vertaa DNA-metylaatioastetta tutkimukseen osallistuneiden eri potilaiden preoperatiivisessa vaiheessa .

MEDAPO-tutkimus on yksikeskinen kliininen tutkimus, jossa käytetään ihmiskudosta in vitro. Koska kirjallisuudessa ei ole tietoa lisääntyneestä DNA-metylaatioasteesta opioidien akuutin annon jälkeen kirurgisille potilaille, tämä tutkimus on tutkiva. Lisäksi, koska opiaateille altistumista ei voida välttää leikkauksensisäisessä vaiheessa, mutta leikkauksen jälkeinen analgesia voidaan taata ilman opioidihoitoja, on mielenkiintoista nähdä tapahtuuko metylaation lisääntymistä jo intraoperatiivisen vaiheen aikana vai voiko se liittyä opiaateille altistumisen aika.

Tämä antaa hyödyllistä tietoa, jotta voidaan paremmin suunnitella satunnaistamisen ajoitus tulevaan tutkimukseen, jossa verrataan erilaisia ​​postoperatiivisia analgeettisia tekniikoita.

Tutkimukseen otetaan mukaan 20 peräkkäistä potilasta, joille tehdään laaja yleisanestesiassa tehty leikkaus ja jotka ovat ilmaisseet suostumuksensa osallistua tutkimukseen. Tämä näyte on riittävä mahdollistamaan mahdollisen DNA-metylaation lisääntymisen havainnointia potilailla, jotka eivät ole aiemmin saaneet opioideja ja jotka ovat altistuneet opiaatteihin perustuvalle anestesialle/kipulääkitykselle nykyisen kliinisen käytännön mukaan.

Tehdään kokeen ensisijaiseen tavoitteeseen liittyvä kuvaava analyysi. Suoritamme parametritestejä pariaineistolle havaitaksemme korrelaatiota DNA:n metylaatioasteen ja akuutin postoperatiivisen kivun välillä.

Kun tietoon perustuvan suostumuksen allekirjoitus, sisällyttämiskriteerien olemassaolo ja poissulkemiskriteerien puuttuminen on tarkistettu, potilas katsotaan kelpoiseksi. Jokaiselle potilaalle annetaan sarjanumero, joka tunnistaa molekyylianalyysissä käytetyt näytteet ja tekee niistä anonyymejä.

Tutkimusjakso ulottuu tietoisen suostumuksen allekirjoittamisesta 48 tuntiin kirurgisen toimenpiteen päättymisen jälkeen.

Tutkimukseen osallistuminen ei muuta potilaan hoitosuunnitelmaa: kirurginen toimenpide ja anestesiakäyttäytyminen edustavat normaalia päivittäistä kliinistä käytäntöä ilman vaihtelua potilaan ilmoittautumisesta riippumatta.

Leikkaussaliin saavuttuaan potilasta seurataan normaalin kliinisen käytännön mukaisesti leikkauksen tyypin mukaan (EKG, SpO2, EtCO2 ja invasiivinen verenpaine). Potilaan seurannan jälkeen sille asetetaan ääreislaskimokatetri ≤ 20 G ja valtimokatetri (20 G) säteittäiseen tai olkaluun valtimoon.

Riittävän hapetuksen jälkeen anestesia indusoidaan fentanyylillä (3 mcg/kg), propofolilla (2-2,5 mg/kg) ja rokuroniumilla (0,6 mg/kg) tai sukkinyylikoliinilla (1 mg/kg). Anestesiatason ylläpito saavutetaan käyttämällä Sevoflurane 0,7 - 1,3 MAC (minimi alveolaarinen pitoisuus) sekä fentanyylin (1 mcg/kg) ja mahdollisesti Rocuroniumin (0,15 mg/kg) bolusannoksia 45 minuutin välein vuoden loppuun asti. leikkaus.

Akuutti postoperatiivinen kipu ensimmäisten 48 tunnin aikana hoidetaan jatkuvalla suonensisäisellä morfiini-infuusiolla (1 mg/h), jolloin potilas voi itse antaa 1 mg:n morfiiniboluksia, jotka toistetaan 8 minuutin välein.

Jatkuvaa morfiinin infuusiota edeltää intraoperatiivinen bolus (välittömästi viimeisen ompeleen jälkeen) 0,1 mg/kg morfiinia. Kymmenen minuuttia heräämisen jälkeen potilaalle, jos kipu on huonosti hallinnassa (NRS ≥ 4), hänelle annetaan 1 mg morfiinia, toistetaan 5 minuutin välein, kunnes NRS <3.

Leikkauksen jälkeisen pahoinvoinnin ja oksentelun ehkäisy suoritetaan antamalla laskimoon 0,1 mg/kg deksametasonia ennen ensimmäisen fentanyyliannoksen antamista. Leikkauksen jälkeisen pahoinvoinnin ja oksentelun yhteydessä annetaan droperidolia 0,625 mg toistettavasti 6 tunnin välein.

Tutkimusjakson aikana keräämme antropometristen parametrien lisäksi seuraavia tietoja:

Anestesian kesto, joka määritellään ajaksi yleisanestesian induktion ja heräämisen välillä; Leikkauksen kesto, joka määritellään kirurgisen viillon ja viimeisen ompeleen väliseksi ajaksi; Fentanyylin kulutus ilmaistuna mikrogrammoina/kg/tunti; Morfiinin kulutus ensimmäisten 24 ja 48 tunnin aikana leikkauksen päättymisen jälkeen; Kipu (NRS) levossa ja syvän sisäänhengityksen jälkeen 10 minuuttia heräämisen jälkeen, 24 ja 48 tuntia leikkauksen päättymisen jälkeen; Pahoinvointi- ja oksentelujaksojen lukumäärä ensimmäisten 24 ja 48 tunnin aikana leikkauksen päättymisen jälkeen; Antiemeettisten lääkkeiden käyttö ensimmäisten 24 ja 48 tunnin aikana leikkauksen päättymisen jälkeen.

Tutkimusjakson aikana rutiininomaisen kliinisen käytännön mukaisesti suoritettavista verikokeista riippuvuuden vuoksi kerätään 5 ml:n verinäyte epigeneettistä analyysiä varten. Simppeliin lisätään antikoagulanttina hepariinia tai EDTA:ta tai askorbaatti-ACD:tä ja säilytetään -20 °C:n lämpötilassa, kunnes se toimitetaan Farmasian ja biotekniikan laitokselle, joka tapahtuu viimeisen verinäytteenoton jälkeen.

Näytteet kerätään seuraavan aikataulun mukaisesti, joka kuvastaa päivittäistä kliinistä käytäntöä:

• T0: valtimokatetrin asettamisen jälkeen, ennen opiaattien (veren peruskaasujen) antamista;
• T1: 1 tunti yleisanestesian induktion jälkeen (mekaanisen ventilaation hemogasananalyysin varmistus);
• T2: viimeisen ompeleen jälkeen, ennen leikkauksensisäistä morfiinibolusta (verenhukkaa mittaava hemogas-analyysi);
• T3: 24 ± 6 tuntia leikkauksen päättymisen jälkeen (verenkuva);
• T4: 48 ± 6 tuntia leikkauksen päättymisen jälkeen (verenkuva). Näistä verinäytteistä arvioidaan DNA:n metylaatioaste. Näytteet uutetaan RNA:sta ja genomisesta DNA:sta ZR-Duet™ -sarjan DNA / RNA Miniprep (Zymo Research) avulla. Näytteistä saatuja nukleiinihappoja säilytetään -80 °C:ssa analyysiin asti.

Koska genomisen DNA:n metylaation muutosta havaitaan useissa sairauksissa, tarve mitata DNA:n kokonaismetylaatioastetta on tullut erittäin tärkeäksi. 5-mC DNA ELISA -pakkaus (Zymo Research) tarjoaa menetelmän korkean suorituskyvyn, helppo tunnistaa ja kvantifioida DNA metylaatioaste.

Kustakin näytteestä uutettua kokonais-RNA:ta käytetään geeniekspressiotutkimuksiin RT-qPCR-menetelmällä. Tämä tekniikka mahdollistaa μ opioidireseptoria ja DNMT-perheeseen kuuluvia entsyymejä koodaavien geenien ilmentymisen kvantitatiivisen arvioinnin. Näiden tulosten perusteella pystymme korreloimaan DNA:n metylaatioasteen tutkittujen geenien ilmentymistasoihin.