DNA-metylering och perioperativ smärtbehandling (MEDAPO)

Under perioperativ period upplever kirurgiska patienter djupgående förändringar i sina fysiologiska processer. Förutom kirurgisk stress beror dessa variationer delvis på farmakologiska behandlingar som vanligtvis används för anestesi och analgesi under och efter kirurgiskt ingrepp.

Opioider är viktiga läkemedel för att hantera akut perioperativ smärta. Under de senaste åren har mycket uppmärksamhet ägnats åt hyperalgesi inducerad av opioider, vilket representerar ett kliniskt signifikant tillstånd efter akut och kronisk exponering för opioider. Det har föreslagits att ökningen av genuttryck av μ-opioidreceptorer och utvecklingen av hyperalgesi skulle kunna kopplas till epigenetiska mekanismer.

Epigenetiska förändringar involverar vanligtvis förändringar i kromatinstrukturen, som består av DNA, histoner och icke-histonproteiner. Huvudförändringar i klinisk miljö är kovalenta modifieringar av N-terminala sekvenser av histonproteiner och DNA-metylering. I synnerhet utförs DNA-metylering med tillägg av en metylgrupp på den femte kolatomen av cytosinrester (5mC), huvudsakligen lokaliserade i CpG-regioner.

DNA-metylering anses vara en mekanism för tystnad av gener. Det är en komplex process som regleras av en hel familj av enzymer som kallas DNA-metyltransferas (DNMT: DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3B och DNMT3L) som katalyserar överföringen av en metylgrupp.

Speciellt DNMT 1, 3a, 3b studerades under utvecklingen av en neuropatisk smärtmodell. Genom immunhistokemisk analys observerades att i dorsalrotgangliet hos en vuxen råtta (L4-5) visade DNMT3B en viktig uppreglering som observeras redan 1 vecka efter induktionen av modellen och som kvarstår i 4 veckor; tvärtom visade DNMT1 och DNMT3a en måttlig och övergående uppreglering. Andra studier har visat att i ett annat mönster av smärta, akut inflammatorisk, är uttrycksnivåerna av DNMT3a och DNMT3B särskilt höga.

Alla dessa fynd tyder på den viktiga aktiviteten hos dessa enzymer i olika smärtmodeller.

Opioideradministrering verkar vara relaterad till en ökning av graden av DNA-metylering. I en studie publicerad 2013 visade Doehring et al. betygsatt graden av DNA-metylering hos patienter som är heroinmissbrukare som genomgår substitutionsbehandling med metadon. Patienter som behandlats med opioider har visat en generell ökning av DNA-metylering, särskilt av μ-opioidreceptorn. Det är intressant att notera att graden av DNA-metylering korrelerar med intensiteten av smärta som rapporterats av försökspersoner som analyserats i studien.

I litteraturen finns för närvarande inga data relaterade till graden av DNA-metylering hos kirurgiska patienter som får akut behandling med opiater som är opioidnaiva före operation.

Det primära syftet med denna studie är att bedöma graden av perioperativ DNA-metylering (extraherad från helblod) hos patienter som genomgår större operationer exponerade för opiater enligt nuvarande klinisk praxis jämfört med preoperativa baslinjenivåer. Tidpunkten (preoperativ vs intraoperativ vs postoperativ) då den möjliga ökningen av graden av DNA-metylering kommer att ske kommer att bedömas.

De sekundära målen är: observera det möjliga sambandet mellan graden av DNA-metylering och intensiteten av akut postoperativ smärta, observera det möjliga sambandet mellan graden av DNA-metylering och förekomsten av postoperativt illamående och kräkningar, observera möjliga samband mellan graden av DNA-metylering och genuttrycket av μ opioidreceptor, observera de möjliga korrelationerna mellan graden av DNA-metylering och uttrycket av gener som huvudsakligen är involverade i metyleringsprocesser, jämför graden av DNA-metylering i den preoperativa fasen av de olika patienter som är involverade i studien .

MEDAPO-studien är en monocentrisk klinisk prövning med användning av mänsklig vävnad in vitro. På grund av bristen på kunskap i litteraturen om den ökade graden av DNA-metylering efter akut administrering av opioider hos kirurgiska patienter, kommer denna studie att vara explorativ. Att dessutom inte kunna undvika exponering för opiater i den intraoperativa fasen, utan att kunna garantera postoperativ analgesi utan opioidbehandlingar, blir det intressant att se om någon ökning av metylering sker redan under den intraoperativa fasen eller om det kan relateras till tidpunkten för exponering för behandling med opiater.

Detta kommer att ge användbar information för att bättre planera tidpunkten för randomisering till en framtida studie som jämför olika postoperativa analgetiska tekniker.

20 på varandra följande patienter som genomgår en större operation utförd under generell anestesi som har uttryckt sitt samtycke till att delta i studien kommer att registreras. Detta prov är tillräckligt för att möjliggöra observation av en möjlig ökning av DNA-metylering hos opioidnaiva patienter som exponerats för anestesi/analgesi baserat på opiater enligt nuvarande klinisk praxis.

Beskrivande analys relaterad till det primära syftet med försöket kommer att utföras. Vi kommer att utföra parametriska tester för parade data för att observera korrelationen mellan graden av DNA-metylering och akut postoperativ smärta.

Efter att ha verifierat underskriften av informerat samtycke, närvaron av inklusionskriterierna och frånvaron av uteslutningskriterier, kommer patienten att anses vara berättigad. Varje patient kommer att tilldelas ett serienummer som identifierar proverna som används för molekylär analys och gör dem anonyma.

Studieperioden kommer att sträcka sig från undertecknandet av informerat samtycke upp till 48 timmar efter avslutat kirurgiskt ingrepp.

Deltagandet i studien kommer inte att förändra patientens behandlingsplan: kirurgiskt ingrepp och anestesi kommer att representera den normala dagliga kliniska praxisen utan någon variation oavsett patientens inskrivning.

Vid ankomst till operationssalen kommer patienten att övervakas enligt standard klinisk praxis i förhållande till typ av operation (EKG, SpO2, EtCO2 och invasivt blodtryck). Efter övervakning av patienten kommer den att placeras en perifer venkateter ≤ 20 G och en artärkateter (20G) i radial- eller humeralartären.

Efter adekvat syresättning kommer anestesi att induceras med fentanyl (3 mcg/kg), propofol (2-2,5 mg/kg) och Rocuronium (0,6 mg/kg) eller succinylkolin (1 mg/kg). Upprätthållandet av narkosnivån kommer att erhållas genom användning av Sevoflurane 0,7 - 1,3 MAC (minsta alveolära koncentration) och bolusdoser av Fentanyl (1mcg/kg) och möjligen av Rocuronium (0,15mg/kg) var 45:e minut fram till slutet av kirurgi.

Den akuta postoperativa smärtan under de första 48 timmarna kommer att behandlas med en kontinuerlig intravenös infusion av morfin (1 mg/h), med möjlighet för patienten att själv administrera bolusar på 1 mg morfin som kan upprepas var 8:e minut.

Kontinuerlig infusion av morfin kommer att föregås av en intraoperativ bolus (direkt efter det sista stygnet) på 0,1 mg/kg morfin. Tio minuter efter uppvaknandet kommer patienten, om smärtan kommer att vara dåligt kontrollerad (NRS ≥ 4), att administreras 1 mg morfin, repeterbart var 5:e minut, tills NRS <3.

Profylax för postoperativt illamående och kräkningar kommer att utföras genom intravenös administrering av 0,1 mg/kg dexametason före administrering av den första dosen fentanyl. Vid postoperativt illamående och kräkningar kommer det att administreras droperidol 0,625 mg repeterbart var 6:e ​​timme.

Under studieperioden kommer vi, förutom de antropometriska parametrarna, att samla in följande data:

Varaktighet av anestesi, definierad som tiden mellan induktion av allmän anestesi och uppvaknande; Operationens varaktighet, definierad som tiden mellan kirurgiskt snitt och det sista stygnet; Fentanylförbrukning, uttryckt i mcg/kg/timme; Morfinkonsumtion under de första 24 och 48 timmarna efter avslutad operation; Smärta (NRS) i vila och efter djup inandning 10 minuter efter uppvaknandet, 24 och 48 timmar efter avslutad operation; Antal episoder av illamående och kräkningar under de första 24 och 48 timmarna efter operationens slut; Konsumtion av antiemetika under de första 24 och 48 timmarna efter avslutad operation.

Under studieperioden, i beroende av blodprover utförda enligt rutinmässig klinisk praxis, kommer ett blodprov på 5 ml att samlas in för att utföra epigenetisk analys. Semplen kommer att tillsättas med heparin eller EDTA eller askorbat ACD som antikoagulerande medel och förvaras vid en temperatur av -20°C fram till leverans till Institutionen för farmaci och bioteknik som kommer att ske efter sista blodprovstagningen.

Prover kommer att samlas in enligt följande schema som återspeglar daglig klinisk praxis:

• T0: efter placering av artärkatetern, före administrering av opiater (baslinjeblodgaser);
• T1: 1 timme efter induktion av generell anestesi (hemogasanalys verifiering av mekanisk ventilation);
• T2: efter det sista stygnet, före den intraoperativa bolusen av morfin (hemogasanalys som testar blodförlust);
• T3: 24 ± 6 timmar efter avslutad operation (kontrollblodräkning);
• T4: 48 ± 6 timmar efter avslutad operation (kontrollblodräkning). På dessa blodprover kommer det att bedömas graden av DNA-metylering. Proverna kommer att utsättas för extraktion av RNA och genomiskt DNA genom ZR-Duet™ kit DNA / RNA Miniprep (Zymo Research). Nukleinsyrorna som erhålls från proverna kommer att lagras vid -80 °C fram till analys.

Eftersom förändringen i metylering av genomiskt DNA observeras i olika sjukdomar, har behovet av att mäta graden av total DNA-metylering blivit mycket viktigt. 5-mC DNA ELISA-kit (Zymo Research) erbjuder en metod för hög genomströmning, lätt att identifiera och kvantifiera graden av DNA-metylering.

Totalt RNA extraherat från varje prov kommer att användas för genexpressionsstudier med RT-qPCR-metoden. Denna teknik gör det möjligt att göra en kvantitativ bedömning av geners uttryck som kodar för μ opioidreceptorn och enzymer som tillhör familjen DNMT. Baserat på dessa resultat kommer vi att kunna korrelera graden av DNA-metylering till nivåerna av uttryck för de undersökta generna.