DNA-Methylierung und perioperative Schmerzbehandlung (MEDAPO)

Während der perioperativen Phase erleben chirurgische Patienten tiefgreifende Veränderungen in ihren physiologischen Prozessen. Zusätzlich zu chirurgischem Stress sind diese Schwankungen teilweise auf pharmakologische Behandlungen zurückzuführen, die üblicherweise für Anästhesie und Analgesie während und nach chirurgischen Eingriffen verwendet werden.

Opioide sind unverzichtbare Medikamente zur Behandlung akuter perioperativer Schmerzen. In den letzten Jahren wurde der durch Opioide induzierten Hyperalgesie, die einen klinisch signifikanten Zustand nach akuter und chronischer Exposition gegenüber Opioiden darstellt, viel Aufmerksamkeit geschenkt. Es wurde vermutet, dass die Zunahme der Genexpression von μ-Opioidrezeptoren und die Entwicklung von Hyperalgesie mit epigenetischen Mechanismen in Verbindung gebracht werden könnten.

Epigenetische Veränderungen beinhalten typischerweise Veränderungen in der Chromatinstruktur, die aus DNA, Histonen und Nicht-Histonproteinen besteht. Die wichtigsten Veränderungen im klinischen Umfeld sind kovalente Modifikationen von N-terminalen Sequenzen von Histonproteinen und DNA-Methylierung. Insbesondere wird die DNA-Methylierung durch Hinzufügen einer Methylgruppe am fünften Kohlenstoffatom von Cytosinresten (5mC) durchgeführt, die hauptsächlich in CpG-Regionen lokalisiert ist.

DNA-Methylierung wird als Mechanismus des Gen-Silencing angesehen. Es ist ein komplexer Prozess, der von einer ganzen Familie von Enzymen namens DNA-Methyltransferase (DNMTs: DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3B und DNMT3L) reguliert wird, die die Übertragung einer Methylgruppe katalysieren.

Insbesondere DNMT 1, 3a, 3b wurden während der Entwicklung eines neuropathischen Schmerzmodells untersucht. Durch immunhistochemische Analyse wurde beobachtet, dass im Spinalganglion einer erwachsenen Ratte (L4-5) DNMT3B eine bedeutende Hochregulierung zeigte, die bereits 1 Woche nach der Induktion des Modells beobachtet wurde und 4 Wochen anhielt; im Gegensatz dazu zeigten DNMT1 und DNMT3a eine moderate und vorübergehende Hochregulierung. Andere Studien haben gezeigt, dass bei einem anderen Schmerzmuster, akuten Entzündungen, die Expressionsniveaus von DNMT3a und DNMT3B besonders hoch sind.

All diese Ergebnisse deuten auf die wichtige Aktivität dieser Enzyme in verschiedenen Schmerzmodellen hin.

Die Gabe von Opioiden scheint mit einer Erhöhung des DNA-Methylierungsgrads in Zusammenhang zu stehen. In einer 2013 veröffentlichten Studie haben Doehring et al. bewerteten den Grad der DNA-Methylierung bei heroinabhängigen Patienten, die sich einer Methadon-Substitutionsbehandlung unterziehen. Patienten, die mit Opioiden behandelt wurden, zeigten einen allgemeinen Anstieg der DNA-Methylierung, insbesondere des μ-Opioidrezeptors. Es ist interessant festzustellen, dass der Grad der DNA-Methylierung mit der Intensität der Schmerzen korreliert, die von den in der Studie analysierten Probanden berichtet wurden.

In der Literatur liegen derzeit keine Daten zum Grad der DNA-Methylierung bei chirurgischen Patienten vor, die eine Akutbehandlung mit opioid-naiven Opiaten vor der Operation erhalten.

Das primäre Ziel dieser Studie ist es, den Grad der perioperativen DNA-Methylierung (aus Vollblut extrahiert) bei Patienten, die sich einer größeren Operation unterziehen und Opiaten gemäß der aktuellen klinischen Praxis ausgesetzt sind, im Vergleich zu den präoperativen Ausgangswerten zu bewerten. Der Zeitpunkt (präoperativ vs. intraoperativ vs. postoperativ), in dem der mögliche Anstieg des DNA-Methylierungsgrades stattfinden wird, wird bewertet.

Die sekundären Ziele sind: Beobachtung der möglichen Korrelation zwischen dem Grad der DNA-Methylierung und der Intensität akuter postoperativer Schmerzen, Beobachtung der möglichen Korrelation zwischen dem Grad der DNA-Methylierung und dem Auftreten von postoperativer Übelkeit und Erbrechen, Beobachtung der möglichen Korrelationen zwischen dem Grad der DNA-Methylierung und die Genexpression des μ-Opioidrezeptors, Beobachtung der möglichen Korrelationen zwischen dem Grad der DNA-Methylierung und der Expression von Genen, die hauptsächlich an Methylierungsprozessen beteiligt sind, Vergleich des Grades der DNA-Methylierung in der präoperativen Phase der verschiedenen an der Studie beteiligten Patienten .

Die MEDAPO-Studie ist eine monozentrische klinische Studie unter Verwendung von menschlichem Gewebe in vitro. Aufgrund des Mangels an Wissen in der Literatur über den erhöhten Grad an DNA-Methylierung nach akuter Verabreichung von Opioiden bei chirurgischen Patienten wird diese Studie explorativ sein. Da darüber hinaus eine Opiatbelastung in der intraoperativen Phase nicht vermieden werden kann, aber eine postoperative Analgesie ohne Opioidbehandlungen gewährleistet werden kann, wird es interessant sein zu sehen, ob eine Erhöhung der Methylierung bereits während der intraoperativen Phase auftritt oder damit zusammenhängen kann die Zeit der Exposition gegenüber der Behandlung mit Opiaten.

Dies wird nützliche Informationen liefern, um den Zeitpunkt für die Randomisierung in einer zukünftigen Studie, in der verschiedene postoperative Analgesietechniken verglichen werden, besser planen zu können.

20 aufeinanderfolgende Patienten, die sich einer größeren Operation unter Vollnarkose unterziehen und ihre Zustimmung zur Teilnahme an der Studie erklärt haben, werden aufgenommen. Diese Probe ist ausreichend, um die Beobachtung eines möglichen Anstiegs der DNA-Methylierung bei Opioid-naiven Patienten zu ermöglichen, die einer Anästhesie/Analgesie auf Basis von Opiaten gemäß der derzeitigen klinischen Praxis ausgesetzt sind.

Es wird eine deskriptive Analyse in Bezug auf das primäre Ziel der Studie durchgeführt. Wir werden parametrische Tests für gepaarte Daten durchführen, um die Korrelation zwischen dem Grad der DNA-Methylierung und akuten postoperativen Schmerzen zu beobachten.

Nach Überprüfung der Unterschrift der Einverständniserklärung, des Vorhandenseins der Einschlusskriterien und des Fehlens von Ausschlusskriterien gilt der Patient als geeignet. Jedem Patienten wird eine Seriennummer zugewiesen, die die für die molekulare Analyse verwendeten Proben identifiziert und sie anonym macht.

Der Studienzeitraum erstreckt sich von der Unterzeichnung der Einverständniserklärung bis zu 48 Stunden nach Ende des chirurgischen Eingriffs.

Die Teilnahme an der Studie wird den Behandlungsplan des Patienten nicht ändern: Das chirurgische Verfahren und die Durchführung der Anästhesie entsprechen der normalen täglichen klinischen Praxis ohne Abweichungen, unabhängig von der Aufnahme des Patienten.

Zum Zeitpunkt der Ankunft im Operationssaal wird der Patient gemäß der klinischen Standardpraxis in Bezug auf die Art des Eingriffs (EKG, SpO2, EtCO2 und invasiver Blutdruck) überwacht. Nach der Überwachung des Patienten wird ihm ein peripherer Venenkatheter ≤ 20 G und ein Arterienkatheter (20 G) in die Radial- oder Humerusarterie gelegt.

Nach ausreichender Oxygenierung wird eine Anästhesie mit Fentanyl (3 mcg/kg), Propofol (2-2,5 mg/kg) und Rocuronium (0,6 mg/kg) oder Succinylcholin (1 mg/kg) eingeleitet. Die Aufrechterhaltung des Anästhesiespiegels wird durch die Anwendung von Sevofluran 0,7 - 1,3 MAC (minimale alveoläre Konzentration) und Bolusdosen von Fentanyl (1 mcg / kg) und möglicherweise Rocuronium (0,15 mg / kg) alle 45 Minuten bis zum Ende erreicht Operation.

Die akuten postoperativen Schmerzen in den ersten 48 Stunden werden mit einer kontinuierlichen intravenösen Infusion von Morphin (1 mg/h) behandelt, mit der Möglichkeit des Patienten, sich alle 8 Minuten wiederholbare Boli von 1 mg Morphin selbst zu verabreichen.

Der kontinuierlichen Infusion von Morphin geht ein intraoperativer Bolus (unmittelbar nach der letzten Naht) von 0,1 mg/kg Morphin voraus. Zehn Minuten nach dem Aufwachen wird dem Patienten, wenn die Schmerzen schlecht kontrolliert werden (NRS ≥ 4), 1 mg Morphin verabreicht, alle 5 Minuten wiederholbar, bis NRS < 3.

Die Prophylaxe für postoperative Übelkeit und Erbrechen wird durch intravenöse Verabreichung von 0,1 mg/kg Dexamethason vor Verabreichung der ersten Fentanyl-Dosis durchgeführt. Bei postoperativer Übelkeit und Erbrechen wird Droperidol 0,625 mg wiederholbar alle 6 Stunden verabreicht.

Während des Studienzeitraums erheben wir zusätzlich zu den anthropometrischen Parametern folgende Daten:

Narkosedauer, definiert als die Zeit zwischen Einleitung der Vollnarkose und Aufwachen; Operationsdauer, definiert als die Zeit zwischen dem chirurgischen Schnitt und dem letzten Stich; Fentanylverbrauch, ausgedrückt in mcg/kg/Stunde; Morphinkonsum in den ersten 24 und 48 Stunden nach Operationsende; Schmerzen (NRS) in Ruhe und nach tiefem Einatmen 10 Minuten nach dem Aufwachen, 24 und 48 Stunden nach OP-Ende; Anzahl der Episoden von Übelkeit und Erbrechen in den ersten 24 und 48 Stunden nach Ende der Operation; Einnahme von Antiemetika in den ersten 24 und 48 Stunden nach Operationsende.

Während des Studienzeitraums wird zusätzlich zu Bluttests, die gemäß der klinischen Routine durchgeführt werden, eine Blutprobe von 5 ml entnommen, um eine epigenetische Analyse durchzuführen. Die Probe wird mit Heparin oder EDTA oder Ascorbat ACD als Gerinnungshemmer versetzt und bei einer Temperatur von - 20 °C bis zur Abgabe an das Institut für Pharmazie und Biotechnologie gelagert, die nach der letzten Blutentnahme erfolgt.

Die Proben werden gemäß dem folgenden Zeitplan gesammelt, der die tägliche klinische Praxis widerspiegelt:

• T0: nach Platzierung des arteriellen Katheters, vor Gabe von Opiaten (Baseline-Blutgase);
• T1: 1 Stunde nach Einleitung der Allgemeinanästhesie (Hämogasanalyse-Verifizierung der mechanischen Beatmung);
• T2: nach der letzten Naht, vor dem intraoperativen Bolus von Morphin (Hämogasanalyse, die den Blutverlust testet);
• T3: 24 ± 6 Stunden nach OP-Ende (Kontrollblutbild);
• T4: 48 ± 6 Stunden nach OP-Ende (Kontrollblutbild). An diesen Blutproben wird der Grad der DNA-Methylierung beurteilt. Die Proben werden der Extraktion von RNA und genomischer DNA durch das ZR-Duet™ Kit DNA/RNA Miniprep (Zymo Research) unterzogen. Die aus den Proben gewonnenen Nukleinsäuren werden bis zur Analyse bei -80°C gelagert.

Da die Veränderung der Methylierung genomischer DNA bei verschiedenen Krankheiten beobachtet wird, ist die Notwendigkeit, den Grad der gesamten DNA-Methylierung zu messen, sehr wichtig geworden. Das 5-mC-DNA-ELISA-Kit (Zymo Research) bietet eine Methode mit hohem Durchsatz, mit der der DNA-Methylierungsgrad einfach identifiziert und quantifiziert werden kann.

Die aus jeder Probe extrahierte Gesamt-RNA wird für Genexpressionsstudien unter Verwendung der RT-qPCR-Methode verwendet. Diese Technik ermöglicht eine quantitative Bewertung der Expression von Genen, die für den μ-Opioidrezeptor und Enzyme kodieren, die zur Familie der DNMTs gehören. Basierend auf diesen Ergebnissen werden wir in der Lage sein, den Grad der DNA-Methylierung mit dem Expressionsniveau der untersuchten Gene zu korrelieren.