Metilación del ADN y tratamiento del dolor perioperatorio (MEDAPO)

Durante el perioperatorio los pacientes quirúrgicos experimentan cambios profundos en sus procesos fisiológicos. Además del estrés quirúrgico, estas variaciones se deben en parte a los tratamientos farmacológicos comúnmente utilizados para la anestesia y la analgesia durante y después del procedimiento quirúrgico.

Los opioides son fármacos esenciales para el manejo del dolor perioperatorio agudo. En los últimos años se ha prestado mucha atención a la hiperalgesia inducida por los opioides, que representa una condición clínicamente significativa después de la exposición aguda y crónica a los opioides. Se ha sugerido que el aumento de la expresión génica de los receptores opioides μ y el desarrollo de hiperalgesia podrían estar relacionados con mecanismos epigenéticos.

Las alteraciones epigenéticas suelen implicar cambios en la estructura de la cromatina, que se compone de ADN, histonas y proteínas no histonas. Los principales cambios en el entorno clínico son las modificaciones covalentes de las secuencias N-terminales de las proteínas histonas y la metilación del ADN. En particular, la metilación del ADN se lleva a cabo con la adición de un grupo metilo en el quinto átomo de carbono de los residuos de citosina (5mC), localizados principalmente en las regiones CpG.

La metilación del ADN se considera un mecanismo de silenciamiento génico. Es un proceso complejo regulado por toda una familia de enzimas llamadas ADN metiltransferasa (DNMT: DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3B y DNMT3L) que catalizan la transferencia de un grupo metilo.

En particular, se estudiaron DNMT 1, 3a, 3b durante el desarrollo de un modelo de dolor neuropático. Mediante análisis inmunohistoquímico se observó que en el ganglio de la raíz dorsal de una rata adulta (L4-5) DNMT3B mostró un importante up-regulation que se observa ya 1 semana después de la inducción del modelo y que persiste durante 4 semanas; por el contrario, DNMT1 y DNMT3a mostraron una sobrerregulación moderada y transitoria. Otros estudios han demostrado que en un patrón diferente de dolor, el inflamatorio agudo, los niveles de expresión de DNMT3a y DNMT3B son particularmente altos.

Todos estos hallazgos sugieren la importante actividad de estas enzimas en diferentes modelos de dolor.

La administración de opioides parece estar relacionada con un aumento del grado de metilación del ADN. En un estudio publicado en 2013, Doehring et al. evaluaron el grado de metilación del ADN en pacientes heroinómanos en tratamiento de sustitución con metadona. Los pacientes tratados con opioides han mostrado un aumento general en la metilación del ADN, en particular del receptor opioide μ. Es interesante notar que el grado de metilación del ADN se correlaciona con la intensidad del dolor reportada por los sujetos analizados en el estudio.

En la literatura actualmente no hay datos presentes relacionados con el grado de metilación del ADN en pacientes quirúrgicos que reciben tratamiento agudo con opiáceos que no son opioides previos a la cirugía.

El objetivo principal de este estudio es evaluar el grado de metilación del ADN perioperatorio (extraído de sangre entera) en pacientes sometidos a cirugía mayor expuestos a opiáceos según la práctica clínica actual en comparación con los niveles preoperatorios basales. Se evaluará el momento (preoperatorio vs intraoperatorio vs postoperatorio) en el que se producirá el posible aumento del grado de metilación del ADN.

Los objetivos secundarios son: observar la posible correlación entre el grado de metilación del ADN y la intensidad del dolor postoperatorio agudo, observar la posible correlación entre el grado de metilación del ADN y la incidencia de náuseas y vómitos postoperatorios, observar las posibles correlaciones entre el grado de Metilación del ADN y expresión génica del receptor opioide μ, observar las posibles correlaciones entre el grado de metilación del ADN y la expresión de genes implicados principalmente en los procesos de metilación, comparar el grado de metilación del ADN en la fase preoperatoria de los diferentes pacientes implicados en el estudio .

El ensayo MEDAPO es un ensayo clínico monocéntrico con el uso de tejido humano in vitro. Debido a la falta de conocimiento en la literatura sobre el mayor grado de metilación del ADN después de la administración aguda de opioides en pacientes quirúrgicos, este estudio será exploratorio. Además, al no poder evitarse la exposición a opiáceos en la fase intraoperatoria, pero siendo posible garantizar la analgesia postoperatoria sin tratamientos con opioides, será interesante ver si se produce algún aumento de la metilación ya durante la fase intraoperatoria o si puede estar relacionado con el tiempo de exposición al tratamiento con opiáceos.

Esto proporcionará información útil para planificar mejor el momento de la aleatorización en un ensayo futuro que compare varias técnicas analgésicas posoperatorias.

Se inscribirán 20 pacientes consecutivos sometidos a cirugía mayor realizada bajo anestesia general que hayan expresado su consentimiento para participar en el estudio. Esta muestra es adecuada para permitir la observación de un posible aumento de la metilación del ADN en pacientes no tratados previamente con opioides expuestos a anestesia/analgesia basada en opiáceos según la práctica clínica actual.

Se realizará un análisis descriptivo relacionado con el objetivo principal del ensayo. Realizaremos pruebas paramétricas para datos apareados para observar la correlación entre el grado de metilación del ADN y el dolor postoperatorio agudo.

Luego de verificar la firma del consentimiento informado, la presencia de los criterios de inclusión y la ausencia de criterios de exclusión, el paciente será considerado elegible. A cada paciente se le asignará un número de serie que identificará las muestras utilizadas para el análisis molecular haciéndolas anónimas.

El período de estudio se extenderá desde la firma del consentimiento informado hasta 48 horas después de la finalización del procedimiento quirúrgico.

La participación en el estudio no cambiará el plan de tratamiento del paciente: el procedimiento quirúrgico y la conducta anestésica representarán la práctica clínica diaria normal sin ninguna variación independientemente de la inscripción del paciente.

En el momento de la llegada al quirófano el paciente será monitorizado según la práctica clínica habitual en relación al tipo de cirugía (ECG, SpO2, EtCO2 y Presión Arterial Invasiva). Tras la monitorización del paciente, se colocará un catéter venoso periférico ≤ 20 G y un catéter arterial (20 G) en arteria radial o humeral.

Tras una adecuada oxigenación se inducirá la anestesia con fentanilo (3 mcg/kg), propofol (2-2,5 mg/kg) y Rocuronio (0,6 mg/kg) o Succinilcolina (1 mg/Kg). El mantenimiento del nivel anestésico se obtendrá mediante el uso de Sevoflurano 0,7 - 1,3 CAM (concentración alveolar mínima), y dosis en bolo de Fentanilo (1 mcg/kg) y posiblemente de Rocuronio (0,15 mg/kg) cada 45 minutos hasta el final de la cirugía.

El dolor agudo del postoperatorio en las primeras 48 horas será tratado con infusión intravenosa continua de morfina (1 mg/h), pudiendo el paciente autoadministrarse bolos de 1 mg de morfina repetibles cada 8 minutos.

La infusión continua de morfina irá precedida de un bolo intraoperatorio (inmediatamente después del último punto) de 0,1 mg/kg de morfina. Diez minutos después de despertar al paciente, si el dolor va a estar mal controlado (NRS ≥ 4), se administrará 1 mg de morfina, repetible cada 5 minutos, hasta NRS<3.

La profilaxis de náuseas y vómitos postoperatorios se realizará mediante la administración intravenosa de 0,1 mg/kg de dexametasona antes de la administración de la primera dosis de fentanilo. En caso de náuseas y vómitos postoperatorios se administrará droperidol 0,625 mg repetible cada 6 horas.

Durante el periodo de estudio, además de los parámetros antropométricos, recogeremos los siguientes datos:

Duración de la anestesia, definida como el tiempo entre la inducción de la anestesia general y el despertar; Duración de la cirugía, definida como el tiempo entre la incisión quirúrgica y el último punto; Consumo de fentanilo, expresado en mcg/kg/hora; Consumo de morfina en las primeras 24 y 48 horas posteriores a la finalización de la cirugía; Dolor (NRS) en reposo y tras inspiración profunda a los 10 minutos de despertar, a las 24 y 48 horas de finalizada la cirugía; Número de episodios de náuseas y vómitos en las primeras 24 y 48 horas posteriores a la finalización de la cirugía; Consumo de fármacos antieméticos en las primeras 24 y 48 horas tras finalizar la cirugía.

Durante el periodo de estudio, además de los análisis de sangre realizados según la práctica clínica habitual, se recogerá una muestra de sangre de 5 ml para realizar el análisis epigenético. La muestra se adicionará con heparina o EDTA o ascorbato ACD como agentes anticoagulantes y se almacenará a una temperatura de -20°C hasta el envío al Departamento de Farmacia y Biotecnología que se realizará después de la última toma de sangre.

Las muestras se recolectarán de acuerdo con el siguiente programa que refleja la práctica clínica diaria:

• T0: después de la colocación del catéter arterial, previo a la administración de opiáceos (gasosemia basal);
• T1: 1 hora después de la inducción de la anestesia general (verificación del hemoanálisis de la ventilación mecánica);
• T2: después del último punto, antes del bolo intraoperatorio de morfina (análisis de hemogases que prueba la pérdida de sangre);
• T3: 24 ± 6 horas después de finalizada la cirugía (hemograma de control);
• T4: 48 ± 6 horas después de finalizada la cirugía (hemograma de control). En estas muestras de sangre se evaluará el grado de metilación del ADN. Las muestras serán sometidas a extracción de ARN y ADN genómico a través del kit ZR-Duet™ DNA/RNA Miniprep (Zymo Research). Los ácidos nucleicos obtenidos de las muestras se conservarán a -80°C hasta su análisis.

Dado que el cambio en la metilación del ADN genómico se observa en varias enfermedades, la necesidad de medir el grado de metilación general del ADN se ha vuelto muy importante. El kit 5-mC DNA ELISA (Zymo Research) ofrece un método de alto rendimiento, fácil de identificar y cuantificar el grado de metilación del ADN.

El ARN total extraído de cada muestra se utilizará para estudios de expresión génica mediante el método RT-qPCR. Esta técnica permitirá realizar una evaluación cuantitativa de la expresión de genes codificantes para el receptor opioide μ y enzimas pertenecientes a la familia de las DNMT. En base a estos resultados, podremos correlacionar el grado de metilación del ADN con los niveles de expresión de los genes investigados.