Metylacja DNA i leczenie bólu okołooperacyjnego (MEDAPO)

W okresie okołooperacyjnym pacjenci operowani doświadczają głębokich zmian w swoich procesach fizjologicznych. Oprócz stresu związanego z zabiegiem chirurgicznym różnice te są częściowo spowodowane zabiegami farmakologicznymi powszechnie stosowanymi do znieczulenia i analgezji podczas i po zabiegu chirurgicznym.

Opioidy są podstawowymi lekami w leczeniu ostrego bólu okołooperacyjnego. W ostatnich latach wiele uwagi poświęcono hiperalgezji wywołanej przez opioidy, która stanowi istotny klinicznie stan po ostrym i przewlekłym narażeniu na opioidy. Sugerowano, że wzrost ekspresji genów receptorów opioidowych μ i rozwój hiperalgezji można powiązać z mechanizmami epigenetycznymi.

Zmiany epigenetyczne zwykle obejmują zmiany w strukturze chromatyny, która składa się z DNA, histonów i białek niehistonowych. Główne zmiany w warunkach klinicznych to kowalencyjne modyfikacje N-końcowych sekwencji białek histonowych i metylacja DNA. W szczególności przeprowadza się metylację DNA poprzez dodanie grupy metylowej na piątym atomie węgla reszt cytozyny (5mC), zlokalizowanych głównie w regionach CpG.

Metylacja DNA jest uważana za mechanizm wyciszania genów. Jest to złożony proces regulowany przez całą rodzinę enzymów zwanych metylotransferazą DNA (DNMT: DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3B i DNMT3L), które katalizują przeniesienie grupy metylowej.

W szczególności DNMT 1, 3a, 3b badano podczas opracowywania modelu bólu neuropatycznego. Za pomocą analizy immunohistochemicznej zaobserwowano, że w zwoju korzenia grzbietowego dorosłego szczura (L4-5) DNMT3B wykazywał istotną regulację w górę, która jest obserwowana już 1 tydzień po indukcji modelu i która utrzymuje się przez 4 tygodnie; wręcz przeciwnie, DNMT1 i DNMT3a wykazywały umiarkowaną i przejściową regulację w górę. Inne badania wykazały, że w innym schemacie bólu, ostrym zapaleniu, poziomy ekspresji DNMT3a i DNMT3B są szczególnie wysokie.

Wszystkie te odkrycia sugerują ważną aktywność tych enzymów w różnych modelach bólu.

Wydaje się, że podawanie opioidów wiąże się ze wzrostem stopnia metylacji DNA. W badaniu opublikowanym w 2013 roku Doehring i in. ocenili stopień metylacji DNA u pacjentów uzależnionych od heroiny poddawanych leczeniu substytucyjnemu metadonem. Pacjenci leczeni opioidami wykazywali ogólny wzrost metylacji DNA, w szczególności receptora opioidowego μ. Warto zauważyć, że stopień metylacji DNA koreluje z intensywnością bólu zgłaszanego przez osoby analizowane w badaniu.

W piśmiennictwie nie ma obecnie danych dotyczących stopnia metylacji DNA u pacjentów chirurgicznych otrzymujących doraźne leczenie opiatami nieleczonych wcześniej opioidami przed operacją.

Głównym celem tego badania jest ocena stopnia okołooperacyjnej metylacji DNA (ekstrahowanego z krwi pełnej) u pacjentów poddawanych dużym operacjom narażonym na działanie opiatów zgodnie z aktualną praktyką kliniczną w porównaniu z przedoperacyjnymi poziomami wyjściowymi. Oceniony zostanie czas (przedoperacyjny vs śródoperacyjny vs pooperacyjny), w którym nastąpi ewentualny wzrost stopnia metylacji DNA.

Celami drugorzędnymi są: obserwacja możliwej korelacji między stopniem metylacji DNA a nasileniem ostrego bólu pooperacyjnego, obserwacja możliwej korelacji między stopniem metylacji DNA a występowaniem nudności i wymiotów pooperacyjnych, obserwacja możliwych korelacji między stopniem metylacja DNA a ekspresja genu receptora opioidowego μ, obserwacja możliwych korelacji między stopniem metylacji DNA a ekspresją genów zaangażowanych głównie w procesy metylacji, porównanie stopnia metylacji DNA w fazie przedoperacyjnej różnych pacjentów biorących udział w badaniu .

MEDAPO to monocentryczne badanie kliniczne z wykorzystaniem tkanki ludzkiej in vitro. Ze względu na brak wiedzy w piśmiennictwie na temat zwiększonego stopnia metylacji DNA po ostrym podaniu opioidów pacjentom chirurgicznym niniejsze badanie będzie miało charakter eksploracyjny. Ponadto, nie będąc w stanie uniknąć narażenia na opiaty w fazie śródoperacyjnej, ale będąc w stanie zagwarantować analgezję pooperacyjną bez leczenia opioidami, interesujące będzie sprawdzenie, czy jakikolwiek wzrost metylacji występuje już w fazie śródoperacyjnej, czy też może być związany z czas ekspozycji na leczenie opiatami.

Dostarczy to przydatnych informacji do lepszego zaplanowania czasu randomizacji do przyszłego badania porównującego różne pooperacyjne techniki przeciwbólowe.

Do badania zostanie włączonych 20 kolejnych pacjentów poddawanych dużym zabiegom chirurgicznym w znieczuleniu ogólnym, którzy wyrazili zgodę na udział w badaniu. Ta próbka jest wystarczająca, aby umożliwić obserwację możliwego wzrostu metylacji DNA u pacjentów nieleczonych wcześniej opioidami, narażonych na znieczulenie/analgezję opartą na opiatach zgodnie z aktualną praktyką kliniczną.

Przeprowadzona zostanie analiza opisowa związana z głównym celem badania. Przeprowadzimy testy parametryczne dla sparowanych danych, aby zaobserwować korelację między stopniem metylacji DNA a ostrym bólem pooperacyjnym.

Po zweryfikowaniu podpisu świadomej zgody, obecności kryteriów włączenia i braku kryteriów wykluczenia, pacjent zostanie uznany za kwalifikującego się. Każdemu pacjentowi zostanie przypisany numer seryjny, który będzie identyfikował próbki użyte do analizy molekularnej czyniąc je anonimowymi.

Okres badania będzie rozciągał się od podpisania świadomej zgody do 48 godzin po zakończeniu zabiegu chirurgicznego.

Udział w badaniu nie zmieni planu leczenia pacjenta: zabieg chirurgiczny i postępowanie anestezjologiczne będą reprezentować normalną codzienną praktykę kliniczną bez żadnych zmian, niezależnie od włączenia pacjenta.

W momencie przyjęcia na salę operacyjną pacjent będzie monitorowany zgodnie ze standardową praktyką kliniczną w zależności od rodzaju operacji (EKG, SpO2, EtCO2 i inwazyjne ciśnienie krwi). Po monitorowaniu pacjenta zostanie założony cewnik do żyły obwodowej ≤ 20 G oraz cewnik dotętniczy (20 G) w tętnicy promieniowej lub ramiennej.

Po odpowiednim natlenieniu znieczulenie zostanie wywołane fentanylem (3 mcg/kg), propofolem (2-2,5 mg/kg) i rokuronium (0,6 mg/kg) lub sukcynylocholiną (1 mg/kg). Utrzymanie poziomu znieczulenia zostanie osiągnięte poprzez zastosowanie sewofluranu 0,7 - 1,3 MAC (minimalne stężenie pęcherzykowe) oraz bolusowe dawki fentanylu (1mcg/kg) i ewentualnie rokuronium (0,15mg/kg) co 45 minut do końca chirurgia.

Ostry ból pooperacyjny w ciągu pierwszych 48 godzin będzie leczony ciągłym dożylnym wlewem morfiny (1 mg/h), z możliwością samodzielnego podania przez pacjenta bolusów 1 mg morfiny powtarzalnych co 8 minut.

Ciągły wlew morfiny będzie poprzedzony bolusem śródoperacyjnym (bezpośrednio po ostatnim szwie) w dawce 0,1 mg/kg morfiny. Dziesięć minut po wybudzeniu choremu, jeśli ból będzie słabo kontrolowany (NRS ≥ 4), podaje się 1 mg morfiny, powtarzając co 5 minut, aż NRS <3.

Profilaktyka pooperacyjnych nudności i wymiotów będzie prowadzona przez dożylne podanie 0,1 mg/kg deksametazonu przed podaniem pierwszej dawki fentanylu. W przypadku nudności i wymiotów pooperacyjnych podaje się droperydol 0,625 mg powtarzalnie co 6 godzin.

W okresie badania oprócz parametrów antropometrycznych będziemy gromadzić następujące dane:

Czas trwania znieczulenia, określany jako czas między wprowadzeniem znieczulenia ogólnego a wybudzeniem; Czas trwania operacji, zdefiniowany jako czas między nacięciem chirurgicznym a ostatnim ściegiem; Zużycie fentanylu wyrażone w mcg/kg/godzinę; Zużycie morfiny w pierwszych 24 i 48 godzinach po zakończeniu operacji; Ból (NRS) w spoczynku i po głębokiej inhalacji 10 minut po przebudzeniu, 24 i 48 godzin po zakończeniu zabiegu; Liczba epizodów nudności i wymiotów w ciągu pierwszych 24 i 48 godzin po zakończeniu operacji; Zażywanie leków przeciwwymiotnych w pierwszych 24 i 48 godzinach po zakończeniu operacji.

W okresie badania, oprócz badań krwi wykonywanych zgodnie z rutynową praktyką kliniczną, zostanie pobrana próbka krwi o objętości 5 ml w celu wykonania analizy epigenetycznej. Próbka zostanie dodana z heparyną lub EDTA lub askorbinianem ACD jako antykoagulantami i przechowywana w temperaturze -20°C do czasu dostarczenia do Zakładu Farmacji i Biotechnologii, co nastąpi po ostatnim pobraniu krwi.

Próbki będą pobierane zgodnie z poniższym harmonogramem odzwierciedlającym codzienną praktykę kliniczną:

• T0: po założeniu cewnika tętniczego, przed podaniem opiatów (wyjściowe gazometrie krwi);
• T1: 1 godzina po indukcji znieczulenia ogólnego (weryfikacja hemogaanalizą wentylacji mechanicznej);
• T2: po ostatnim szwie, przed śródoperacyjnym bolusem morfiny (hemogaanaliza badająca utratę krwi);
• T3: 24 ± 6 godzin po zakończeniu zabiegu (kontrolna morfologia krwi);
• T4: 48 ± 6 godzin po zakończeniu zabiegu (kontrolna morfologia krwi). Na tych próbkach krwi zostanie oceniony stopień metylacji DNA. Próbki zostaną poddane ekstrakcji RNA i genomowego DNA za pomocą zestawu ZR-Duet™ DNA/RNA Miniprep (Zymo Research). Kwasy nukleinowe uzyskane z próbek będą przechowywane w temperaturze -80°C do czasu analizy.

Ponieważ zmiany w metylacji genomowego DNA obserwuje się w różnych chorobach, potrzeba pomiaru stopnia całkowitej metylacji DNA stała się bardzo ważna. Zestaw 5-mC DNA ELISA (Zymo Research) oferuje metodę wysokowydajnej, łatwej do identyfikacji i ilościowego określenia stopnia metylacji DNA.

Całkowity RNA wyekstrahowany z każdej próbki zostanie wykorzystany do badań ekspresji genów metodą RT-qPCR. Technika ta pozwoli na ilościową ocenę ekspresji genów kodujących receptor opioidowy μ oraz enzymy należące do rodziny DNMT. Na podstawie tych wyników będziemy mogli skorelować stopień metylacji DNA z poziomami ekspresji badanych genów.