尿代謝物を用いたスポーツ関連脳震盪の診断

バックグラウンド：

スポーツ脳震盪またはスポーツ関連の軽度の外傷性脳損傷 (mTBI) は、年齢、人種、性別を問わず患者に影響を与えます。 適切に治療しないと、患者や家族に壊滅的な結果をもたらす可能性があるのは医学的問題です。 MTBI または脳震盪 (この提案では同じ意味で使用される用語) は最近、メディアで注目されているトピックであり、著名な政治家やスポーツ選手が脳震盪の結果としてキャリアを変えることになっています。 カナダ保健情報研究所によると、2003 年から 2004 年にかけて、カナダの病院における TBI 入院の 3 番目に多い原因は、スポーツとレクリエーション活動でした。 米国では、疾病管理予防センターは、毎年 160 万から 380 万件の脳震盪がスポーツやレクリエーション活動で発生していると推定しています。 カルガリーでは、2013 年に約 10,000 人の患者が頭部外傷で救急部門を受診し、その 80% が mTBI と診断され、その大多数がスポーツ関連でした (未発表データ)。

現在、患者がスポーツ脳震盪に苦しんでいるかどうか、またそうであれば回復にどれくらいの時間がかかるかを客観的に判断するための単一の「ゴールド スタンダード」評価または診断マーカーはありません。 そのため、脳震盪は、心的外傷後症状、身体的徴候、および認知機能の障害に基づく臨床診断のままであり、訓練を受けた経験豊富な医療専門家によって行われるのが最善です. しかし、これは主に診断に対する質的で個別化されたアプローチであり、通常、客観的な臨床所見の欠如によって曇っています. スポーツ脳震盪評価ツール 3 (SCAT3) (付録 1) などの他の評価ツールは、臨床医が脳震盪を診断するのに役立ちますが、残念ながらこれは検証されておらず、専門家のコンセンサスに基づいて開発されました。 同様に、コンピューター化された神経心理学的テストは、脳震盪の回復の評価に役立つ場合があります。しかし、費用がかかり、時間がかかり、頭部外傷に対する特異性と感度に欠けていると最近批判されています。

過去 20 年間、研究者は、脳震盪の診断と予後を予測するための定量的アプローチを見つけることを期待して、S100B やニューロン特異的エノラーゼなどのバイオマーカーを研究してきました。 残念なことに、これらのマーカーのどれもそれ自体で、臨床現場で単一のバイオマーカーとして使用するのに十分な特異性または感度を持っていないため、これは多くの失望に直面しています.

メタボロミクスは、「病態生理学的刺激または遺伝子改変に対する生体系の代謝応答の定量的測定」と定義され、陽子核磁気共鳴分光法 (1H NMR) および/または質量分析などの分析プラットフォームに基づいています。 血液や尿などの臨床的に利用可能な生体液のメタボロミクス研究は、この反応に対する複雑で比較的非侵襲的なスナップショットを提供します。 現在までに、メタボロミクスは、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、新生児低酸素性虚血性脳症、脳腫瘍、多発性硬化症、老化および神経変性疾患、てんかん、脳卒中、重度の外傷性脳損傷および小児科における有用なバイオマーカー ツールであることが示されています。敗血症ショック。 私たちの知る限り、定量的メタボロミクス プロファイリングをスポーツ脳震盪の診断および予知ツールとして評価した研究はありません。

このパイロット スタディは、次の点で役立ちます。

1. スポーツ脳震盪集団におけるメタボロミクスのテストの実現可能性を判断します。
2. 急性スポーツ脳震盪の診断を支援するために定量的代謝プロファイリングを使用するこの種の最初の研究。
3. 急性スポーツ脳震盪の回復を予測するのに役立つ可能性がある代謝の「指紋」を開発するこの種の最初の研究。

被験者は、負傷前および脳震盪後の午前7時から9時の間に中間尿サンプルを提供するよう求められます。 尿のアリコートを遠心分離によって直ちに採取し、分析に必要になるまで-80℃で保存します。 すべてのサンプルが収集されると、それらはまとめられ、分析のためにレスブリッジ大学に運ばれます。

メタボロミクス分析用のサンプルは、以前の凍結/解凍サイクルを受けません。 各尿サンプルから 450 μl のアリコートを取り出し、250 μl の緩衝液に加えます。 緩衝溶液は、0.5M および pH 7.4 ± 0.04 のリン酸カリウム溶液を使用して調製されます。 この緩衝液には、抗菌剤として作用するアジ化ナトリウム 10 mL も含まれています。 バッファーの溶媒は、1 部の D2O に対して 4 部の通常の水で、D2O には 0.05 重量パーセントの 3-(トリメチルシリル) プロピオン酸 (TSP) が含まれます。 TSP の最終濃度は、内部化学シフトおよび定量基準として使用されます。 次に、緩衝液/尿溶液を 10,000 rpm で 5 分間遠心分離して、粒子状物質、大きな脂肪、または大きなタンパク質を除去し、500 μl を 5 mm NMR チューブにピペットで移します。

すべての NMR スペクトルは、ハイスループット サンプル チェンジャー プラットフォーム、三重共鳴 (TBO) 5 mm プローブ、および TopSpin 3.2 ソフトウェアを備えた Bruker AVANCE III HD 700 MHz 分光計 (Bruker BioSpin Ltd.、カナダ、オンタリオ州ミルトン) で取得されます。 各サンプルは、混合時間 10 ms、取得時間 5 秒、リサイクル遅延 4 秒、合計 512 スキャンで、標準の Bruker 1D 事前飽和パルス シーケンス (noesygppr1d) を使用して取得されます。 次に、各サンプルは、0.3 Hz の線の広がりで処理されます。

TopSpin 3.2 での最初の処理の後、すべてのスペクトルが matNMR (24) に読み込まれ、TSP シフトを 0 ppm に設定することで正しく参照され、さらに処理するために Matlab ® ワークスペースにエクスポートされます。 スペクトルは、Matlab 環境用にコーディングされた動的適応ビニング (DAB) メソッドを使用してビニングされます。 この DAB メソッドは、サンプル間の pH のわずかな変動 (pH = 7.4 ± 0.04) によって引き起こされるスペクトル間のスペクトル線の動きを処理し、同じ代謝物からのピークが別の代謝物に分解されないようにします。ビン。 スペクトル ビニングの後、水と尿素を正規化から除外してスペクトルを正規化し、パレート スケールします (26)。 正規化およびスケーリングされたスペクトルは、主成分分析 (PCA) および部分最小二乗判別分析 (PLS-DA) を使用して分析されます。 これら 2 つの方法のローディング プロットは、範囲外のビンを識別するために使用されます。 次に、これらの範囲外のビンに関連付けられた化学シフト範囲を、確立された代謝物ライブラリと比較して、どの代謝物が比較グループ (脳震盪および前損傷) 間で変動するかを判断します。 TopSpin 3.2 ソフトウェアの Eretic ツールを使用して、これらの代謝産物の濃度の定量的変化を決定します。 この濃度の定量化は、NMR サンプル中の TSP の既知の内部濃度に基づいています。 代謝分析のためのマン・ホイットニーの U 検定と、カテゴリーデータのためのフィッシャーの正確確率検定が実行されます。