Diagnosi di commozione cerebrale correlata allo sport utilizzando i metaboliti delle urine

Sfondo:

La commozione cerebrale sportiva o la lesione cerebrale traumatica lieve (mTBI) correlata allo sport colpisce i pazienti in tutto lo spettro di età, razza e sesso. È un problema medico che, se non trattato adeguatamente, può avere esiti devastanti per pazienti e famiglie. MTBI o commozione cerebrale (terminologia usata in modo intercambiabile in questa proposta) più recentemente è stato un argomento caldo nei media con politici e atleti di alto profilo che hanno avuto esiti che alterano la carriera a seguito di una commozione cerebrale. Secondo il Canadian Institute for Health Information, le attività sportive e ricreative sono state la terza causa principale di ricoveri per trauma cranico negli ospedali canadesi nel 2003-2004. Negli Stati Uniti, il Center for Disease Control and Prevention stima che ogni anno si verifichino da 1,6 a 3,8 milioni di commozioni cerebrali nelle attività sportive e ricreative. A Calgary, nel 2013 sono stati visitati nei reparti di emergenza circa 10.000 pazienti con un trauma cranico, l'80% dei quali è stato diagnosticato come mTBI e la stragrande maggioranza di questi era correlata allo sport (dati non pubblicati).

Attualmente, non esiste un singolo "gold standard" di valutazione o marcatore diagnostico per determinare oggettivamente se un paziente ha subito una commozione cerebrale sportiva e, in tal caso, quanto tempo ci vorrà per riprendersi. In quanto tale, la commozione cerebrale rimane una diagnosi clinica basata su sintomi post-traumatici, segni fisici e compromissione della funzione cognitiva, che nella migliore delle ipotesi viene effettuata da un professionista medico qualificato ed esperto. Ma questo è principalmente un approccio qualitativo e individualizzato alla diagnosi ed è tipicamente offuscato dalla mancanza di risultati clinici oggettivi. Altri strumenti di valutazione possono aiutare un medico a diagnosticare una commozione cerebrale come lo Sport Concussion Assessment Tool 3 (SCAT3) (Appendice 1), ma sfortunatamente questo non è stato convalidato ed è stato sviluppato sulla base del consenso degli esperti. Inoltre, i test neuropsicologici computerizzati possono aiutare nella valutazione del recupero dalla commozione cerebrale; tuttavia è costoso, richiede tempo ed è stato recentemente criticato in quanto privo di specificità e sensibilità per il trauma cranico.

Negli ultimi 20 anni i ricercatori hanno studiato biomarcatori come S100B e l'enolasi neurone-specifica nella speranza di trovare un approccio quantitativo alla diagnosi e alla prognosi della commozione cerebrale. Questo purtroppo ha incontrato molta delusione poiché nessuno di questi marcatori, di per sé, ha un'adeguata specificità o sensibilità per essere utilizzato come singolo biomarcatore nella pratica clinica.

La metabolomica è definita come "la misurazione quantitativa della risposta metabolica dei sistemi viventi a stimoli fisiopatologici o modificazioni genetiche" e si basa su piattaforme analitiche come la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare protonica (1H NMR) e/o la spettrometria di massa. Studi metabolomici di biofluidi clinicamente accessibili, come sangue e urina, forniscono un'istantanea complessa e relativamente non invasiva di questa risposta. Ad oggi, la metabolomica ha dimostrato di essere un utile strumento di biomarcatori nella sclerosi laterale amiotrofica, nel morbo di Alzheimer, nel morbo di Parkinson, nell'encefalopatia ipossico-ischemica neonatale, nel cancro al cervello, nella sclerosi multipla, nell'invecchiamento e nelle malattie neurodegenerative, nell'epilessia, nell'ictus, nel trauma cranico grave e nella shock settico. Per quanto ne sappiamo, nessuno studio ha valutato il profilo metabolomico quantitativo come strumento diagnostico e prognostico nella commozione cerebrale sportiva.

Questo studio pilota contribuirebbe a quanto segue:

1. Per determinare la fattibilità di testare la metabolomica nella popolazione di commozione cerebrale sportiva.
2. Il primo studio nel suo genere a utilizzare la profilazione metabolica quantitativa per assistere nella diagnosi di commozione cerebrale acuta da sport.
3. Il primo studio nel suo genere a sviluppare una "impronta digitale" metabolica che può aiutare a prevedere il recupero in una commozione cerebrale acuta da sport.

Ai soggetti verrà chiesto di fornire un campione di urina a medio flusso tra le 7 e le 9 del mattino prima della lesione e dopo la commozione cerebrale. Le aliquote di urina saranno ottenute immediatamente mediante centrifuga e quindi conservate a -80°C fino al momento dell'analisi. Una volta raccolti tutti i campioni, verranno raggruppati e trasportati all'Università di Lethbridge per l'analisi.

Nessun campione per l'analisi metabolomica verrà sottoposto a un precedente ciclo di congelamento/scongelamento. Un'aliquota di 450 μl verrà prelevata da ciascuno dei campioni di urina e aggiunta a 250 μl di soluzione tampone. La soluzione tampone sarà preparata utilizzando una soluzione di fosfato di potassio a 0.5 M e pH 7.4 ± 0.04. Questa soluzione tampone contiene anche 10 mL di sodio azide che agisce come agente antimicrobico. Il solvente per il tampone sarà 1 parte di D2O in 4 parti di acqua normale e il D2O contiene lo 0,05 percento in peso di acido 3-(trimetilsilil)propionico-2,2,3,3-d4 (TSP). La concentrazione finale di TSP sarà utilizzata come standard di quantificazione e spostamento chimico interno. La soluzione tampone/urina viene quindi centrifugata a 10.000 rpm per cinque minuti per rimuovere eventuali particolati, grassi di grandi dimensioni o proteine ​​di grandi dimensioni e 500 μl vengono pipettati in tubi NMR da 5 mm.

Tutti gli spettri NMR saranno ottenuti su uno spettrometro Bruker AVANCE III HD 700 MHz (Bruker BioSpin Ltd., Milton, ON, Canada) dotato di una piattaforma di scambio di campioni ad alta produttività, una sonda a tripla risonanza (TBO) da 5 mm e software TopSpin 3.2. Ogni campione verrà acquisito utilizzando la sequenza di impulsi di pre-saturazione Bruker 1D standard (noesygppr1d) con un tempo di miscelazione di 10 ms, un tempo di acquisizione di 5 secondi, un ritardo di riciclo di 4 secondi e un totale di 512 scansioni. Ogni campione verrà quindi elaborato con un allargamento di linea di 0,3 Hz.

Dopo l'elaborazione iniziale in TopSpin 3.2, tutti gli spettri verranno caricati in matNMR (24), referenziati correttamente impostando lo spostamento TSP a 0 ppm ed esportati nell'area di lavoro Matlab ® per un'ulteriore elaborazione. Gli spettri verranno quindi raggruppati utilizzando un metodo DAB (Dynamic Adaptive Binning) che è stato codificato per l'ambiente Matlab. Questo metodo DAB si occupa di qualsiasi movimento nelle righe spettrali da uno spettro all'altro, che può essere causato da una leggera variazione di pH da campione a campione (pH = 7,4 ± 0,04) e garantisce che i picchi dello stesso metabolita non vengano scomposti in diversi bidoni. Dopo il binning spettrale, gli spettri saranno normalizzati, con acqua e urea escluse dalla normalizzazione, e Pareto scaled (26). Gli spettri normalizzati e scalati saranno quindi analizzati utilizzando l'analisi delle componenti principali (PCA) e l'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali (PLS-DA). Il grafico dei carichi di questi due metodi verrà utilizzato per identificare i contenitori periferici. L'intervallo di spostamento chimico associato a questi contenitori periferici verrà quindi confrontato con una libreria di metaboliti consolidata al fine di determinare quali metaboliti presentano variazioni tra i gruppi di confronto (commozione cerebrale e pre-infortunio). Lo strumento eretico nel software TopSpin 3.2 verrà utilizzato per determinare i cambiamenti quantitativi nella concentrazione di questi metaboliti. Questa quantificazione della concentrazione si basa sulla concentrazione interna nota di TSP nei nostri campioni NMR. Verranno eseguiti un test U di Mann Whitney per l'analisi metabolica e un test esatto di Fisher per i dati categorici.