소변 대사체를 이용한 스포츠 관련 뇌진탕의 진단

배경:

스포츠 뇌진탕 또는 스포츠 관련 경미한 외상성 뇌 손상(mTBI)은 연령, 인종 및 성별 스펙트럼에 걸쳐 환자에게 영향을 미칩니다. 적절하게 치료하지 않으면 환자와 가족에게 치명적인 결과를 초래할 수 있는 것은 의학적 문제입니다. MTBI 또는 뇌진탕(이 제안에서 상호 교환적으로 사용되는 용어)은 최근 언론에서 유명 정치인과 운동선수가 뇌진탕 후 결과를 바꾸는 뜨거운 주제였습니다. 캐나다 보건 정보 연구소(Canadian Institute for Health Information)에 따르면 스포츠 및 레크리에이션 활동은 2003-2004년 캐나다 병원에서 TBI 입원의 세 번째 주요 원인이었습니다. 미국 질병통제예방센터(Center for Disease Control and Prevention)는 매년 스포츠 및 레크리에이션 활동에서 160만~380만 건의 뇌진탕이 발생한다고 추정합니다. 캘거리에서는 2013년에 약 10,000명의 환자가 두부 손상으로 응급실을 찾았고, 그 중 80%는 mTBI로 진단되었고 이들 중 대다수는 스포츠와 관련이 있었습니다(미공개 데이터).

현재, 환자가 스포츠 뇌진탕을 앓았는지 여부와 그렇다면 회복하는 데 걸리는 시간을 객관적으로 결정하기 위한 단일 "골드 표준" 평가 또는 진단 마커는 없습니다. 따라서 뇌진탕은 외상 후 증상, 신체 징후 및 인지 기능 손상을 기반으로 하는 임상 진단으로 남아 있으며, 이는 기껏해야 훈련되고 경험이 풍부한 의료 전문가가 수행합니다. 그러나 이것은 주로 진단에 대한 정성적이고 개별화된 접근 방식이며 일반적으로 객관적인 임상 결과가 부족하여 흐려집니다. 다른 평가 도구는 스포츠 뇌진탕 평가 도구 3(SCAT3)(부록 1)과 같은 뇌진탕 진단에서 임상의를 도울 수 있지만 불행히도 이것은 검증되지 않았으며 전문가 합의를 기반으로 개발되었습니다. 또한 전산화된 신경심리학적 검사는 뇌진탕 회복 평가에 도움이 될 수 있습니다. 그러나 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 최근 머리 부상에 대한 특이성과 민감성이 부족한 것으로 비판을 받았습니다.

지난 20년 동안 연구원들은 뇌진탕 진단 및 예후에 대한 정량적 접근 방식을 찾기 위해 S100B 및 신경 특정 에놀라제와 같은 바이오마커를 연구했습니다. 불행하게도 이러한 마커 중 어느 것도 그 자체로 임상 실습에서 단일 바이오마커로 사용하기에 적절한 특이성 또는 민감도를 가지고 있지 않기 때문에 이것은 많은 실망을 안겨주었습니다.

대사체학은 "병태생리학적 자극 또는 유전적 변형에 대한 살아있는 시스템의 대사 반응의 정량적 측정"으로 정의되며 양성자 핵 자기 공명 분광법(1H NMR) 및/또는 질량 분석법과 같은 분석 플랫폼을 기반으로 합니다. 혈액 및 소변과 같이 임상적으로 접근 가능한 생체액에 대한 대사체학 연구는 이 반응에 대한 복잡하고 상대적으로 비침습적인 스냅샷을 제공합니다. 현재까지 대사체학은 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 신생아 저산소성 허혈성 뇌병증, 뇌암, 다발성 경화증, 노화 및 신경퇴행성 질환, 간질, 뇌졸중, 중증 외상성 뇌손상 및 소아 패혈성 쇼크. 우리가 아는 한, 스포츠 뇌진탕의 진단 및 예후 도구로서 정량적 대사 프로파일링을 평가한 연구는 없습니다.

이 파일럿 연구는 다음을 지원합니다.

1. 스포츠 뇌진탕 인구에서 대사체학 테스트의 타당성을 결정합니다.
2. 급성 스포츠 뇌진탕의 진단을 돕기 위해 정량적 대사 프로파일링을 사용한 최초의 연구입니다.
3. 급성 스포츠 뇌진탕에서 회복을 예측하는 데 도움이 될 수 있는 대사 "지문"을 개발하는 최초의 연구입니다.

피험자는 부상 전과 뇌진탕 후 오전 7-9시 사이에 중간 소변 샘플을 제공하도록 요청받을 것입니다. 소변 분취량은 원심분리기로 즉시 얻은 다음 분석에 필요할 때까지 -80C에 보관합니다. 모든 샘플이 수집되면 일괄 처리되어 분석을 위해 University of Lethbridge로 이송됩니다.

대사체 분석을 위한 샘플은 이전 동결/해동 주기를 거치지 않습니다. 450μl의 분취량을 각 소변 샘플에서 제거하고 250μl의 완충액에 첨가합니다. 완충 용액은 0.5M 및 pH 7.4 ± 0.04의 인산칼륨 용액을 사용하여 준비됩니다. 이 완충 용액에는 항균제 역할을 하는 아지드화나트륨 10mL도 포함되어 있습니다. 완충용 용매는 D2O 1부 대 일반 물 4부이며 D2O는 0.05중량%의 3-(트리메틸실릴)프로피온-2,2,3,3-d4산(TSP)을 포함합니다. TSP의 최종 농도는 내부 화학적 이동 및 정량화 표준으로 사용됩니다. 그런 다음 버퍼/소변 용액을 5분 동안 10,000rpm에서 원심분리하여 미립자 물질, 큰 지방 또는 큰 단백질을 제거하고 500μl를 5mm NMR 튜브에 피펫팅합니다.

모든 NMR 스펙트럼은 고처리량 시료 교환기 플랫폼, 삼중 공명(TBO) 5mm 프로브 및 TopSpin 3.2 소프트웨어가 장착된 Bruker AVANCE III HD 700MHz 분광계(Bruker BioSpin Ltd., Milton, ON, Canada)에서 얻을 것입니다. 각 샘플은 표준 Bruker 1D 사전 포화 펄스 시퀀스(noesygppr1d)를 사용하여 혼합 시간 10ms, 획득 시간 5초, 재순환 지연 4초 및 총 512회 스캔을 사용하여 획득됩니다. 그런 다음 각 샘플은 0.3Hz의 라인 확장으로 처리됩니다.

TopSpin 3.2에서 초기 처리 후 모든 스펙트럼은 matNMR(24)에 로드되고 TSP 이동을 0ppm으로 설정하여 올바르게 참조되며 추가 처리를 위해 Matlab ® 작업 공간으로 내보내집니다. 스펙트럼은 Matlab 환경용으로 코딩된 동적 적응 비닝(DAB) 방법을 사용하여 비닝됩니다. 이 DAB 방법은 샘플 간 pH의 약간의 변화(pH = 7.4 ± 0.04)로 인해 발생할 수 있는 스펙트럼 간 스펙트럼 선의 모든 이동을 처리하고 동일한 대사 산물의 피크가 다른 쓰레기통. 스펙트럼 비닝 후 스펙트럼은 정규화에서 제외된 물과 요소를 사용하여 정규화되고 파레토 스케일링됩니다(26). 정규화 및 스케일링된 스펙트럼은 주성분 분석(PCA) 및 부분 최소 제곱 판별 분석(PLS-DA)을 사용하여 분석됩니다. 이 두 가지 방법의 로딩 플롯은 외부 빈을 식별하는 데 사용됩니다. 그런 다음 비교 그룹(뇌진탕 및 부상 전)에 걸쳐 변화가 있는 대사 산물을 결정하기 위해 이러한 외곽 빈과 관련된 화학적 이동 범위를 확립된 대사 산물 라이브러리와 비교합니다. TopSpin 3.2 소프트웨어의 Eretic 도구는 이러한 대사 산물 농도의 정량적 변화를 결정하는 데 사용됩니다. 이 농도의 정량화는 NMR 샘플에서 TSP의 알려진 내부 농도를 기반으로 합니다. 대사 분석을 위한 Mann Whitney U 테스트와 범주 데이터를 위한 Fisher 정확 테스트가 수행됩니다.